Взятие крови у животных для лабораторных исследований: Правила отбора проб на серологические исследования — Удмуртский ветеринарно-диагностический центр

Разное

Содержание

Рекомендации по правилам взятия проб крови от крупного рогатого скота

  Рекомендации

по правилам взятия проб крови от крупного рогатого скота

Условия взятия крови и ее сохранность до начала лабораторных исследований имеют важное значение при получении достоверных результатов. Во многом эти результаты зависят от техники взятия крови и используемых при этой инструментов.

При венепункции прокол окружающих вену тканей и стенки вен делают в один прием.

На результаты лабораторных исследований могут влиять факторы, связанные с индивидуальными особенностями и физиологическим состоянием организма животного, такие как: возраст; эмоциональное состояние и психический стресс; климатические и метеорологические условия и др.

Брать кровь надо по возможности утром, до кормления животных.

Рекомендуется произвести дегельминтизацию животных за 2 недели до взятия крови.

В целях отсутствия получения ложно-положительных результатов исследований рекомендуют брать кровь не позднее, чем за три недели до отела и не ранее чем через 3 недели после отела.

На точность и правильность результатов также оказывает влияние техника взятия крови, используемые при этом инструменты (иглы, шприцы и др.), пробирки, в которые берется, а в последующем хранится и транспортируется кровь, а также условия хранения и подготовки пробы к анализу.

Традиционные и широко используемые в настоящее время способы взятия крови с помощью иглы и/или шприца оказываются основными источниками лабораторных ошибок, приводящих к низкому качеству результатов анализов. Кроме того, эти методы не могут быть стандартизованы и не обеспечивают безопасность персонала, берущего кровь.

При взятии проб венозной крови методом самотека с использованием иглы и обычных пробирок высока вероятность попадания крови животного на руки ветеринарного специалиста. В этом случае руки ветеринарного работника могут стать источником передачи и распространения возбудителей гемоконтактных инфекций другому животному путем контаминации кровью инъекционной ранки. Ветеринарный работник сам может заразиться от источника инфекции.

Использование медицинского шприца с иглой для взятия крови следует также избегать из-за его недостаточной безопасности для ветеринарного персонала и невозможности исключения гемолиза крови при переносе пробы под давлением в пробирку.

Взятие крови с использованием вакуум-содержащих систем:

Для взятия проб венозной крови наиболее предпочтительно использовать вакуум-содержащие системы. Этот способ имеет ряд преимуществ, основным из которых является то, что кровь попадает непосредственно в закрытую пробирку, предотвращающую любой контакт ветперсонала с кровью животного.

Речь идёт не только об упрощении процедуры взятия крови, что само по себе немаловажно, но и о значительном снижении процента преаналитических ошибок, увеличении безопасности процедуры, снижении риска заражения скота, сохранения уровня надоев после процедуры и отсутствия осложнений у животных после взятия крови.

Вакуум-содержащая система представляет собой закрытую двухкомпонентную систему — вакуумный шприц-контейнер и специальную иглу. Выделение сыворотки или соединение крови с антикоагулянтом происходит в том же объёме шприца, в который берётся кровь, то есть после взятия крови сам шприц является транспортной пробиркой с антикоагулянтом или сывороткой.

Под действием вакуума кровь втягивается через иглу вакуумной системы напрямую из вены в пробирку и сразу же смешивается с химическим реактивом. Тщательно дозированный объем вакуума обеспечивает точное соотношение кровь/реагент в пробирке.

На основе возможностей вакуум-содержащихх систем был разработан новый метод взятия крови у крупного рогатого скота из хвостовой вены:

  1. Кровь берут из v .с occygea (хвостовая вена).
  2. Для взятия крови животное не фиксируют.
  3. Хвост животного берут рукой в области средней трети и  медленно поднимают вверх.
  4. Место взятия крови, область 2-5 хвостовых позвонков, дезинфицируют спиртом или 5%  раствором йода.
  5. Кровь берут в средней трети тела 2-5 хвостовых позвонков, находящейся на линии, идущей вдоль хвоста и делящей его на 2 симметричные части.
  6. Иглу вводят под углом 90° до  упора на глубину 5-10 мм.

Преимущества взятия крови безопасными системами из хвостовой вены:

1.     Сокращение времени взятия крови ветврачом; (до 200 животных за 2 часа)

2.     Отсутствие фиксации животного;

3.     Исключение контакта ветврача с кровью на всех этапах взятия и транспортировки крови;

4.     Предупреждение распространения инфекций через кровь и загрязнения (контаминации) объектов окружающей среды; (особенно актуально при лейкозе КРС)

5.     Минимизация осложнений и стресса у животных;

6.     Отсутствие сокращения надоев в результате стресса и осложнений

7.     Возможность получения стерильной крови.

Взятие крови с использованием кровобрательных игл и пробирок:

Иглы для взятия крови должны быть с коротким срезом и достаточно большим диаметром, чтобы не травмировать противоположную стенку вены и не вызвать повреждения эритроцитов. Иглы перед взятием крови обязательно стерилизуют кипячением. Шерсть на месте взятия крови тщательно выстригают, а кожу дезинфицируют дезинфицирующим раствором.

У крупного рогатого окота кровь берут из яремной вены в верхней трети шеи.

Брать кровь для получения сыворотки надо по возможности утром, до кормления животных. Для серологического исследования берут по 7-10 мл крови от крупного рогатого скота.

При взятии крови из яремной вены иглу вкалывают на границе перехода верхней трети шеи в среднюю. Чтобы вызвать достаточное наполнение вены и уменьшать ее подвижность, вену сдавливает в середине шеи резиновым жгутом или пальцем. При проколе вены необходимо держать иглу в руке так, чтобы направление ее совпало с линией хода вены и чтобы срез иглы был направлен вверх, к голове. Иглу вкалывают под острым углом – в 20–30°. При попадании в вену из иглы вытекает кровь.

Кровь должна стекать по стенке пробирки по избежании разрушения эритроцитов и при необходимости немедленно смешиваться с достаточным количеством антикоагулянта.

Перед извлечением иглы из вены резиновый жгут снимают, пережимают вену пальцем выше места вкола, иглу извлекают, а место вкола некоторое время сдавливают тампоном для предотвращения образования гематомы. В заключении область венепункции дезинфицируют дезинфицирующим раствором.  

Недостатки устоявшегося метода взятия крови из яремной вены кровопускательной иглой:

  1. Разбрызгивание крови; (попадание крови на руки, кормушки и др. объекты окружающей среды).
  2. Высокий риск распространения инфекций, опасных не только для животных, но и для человека; (туберкулез, бруцеллез, лейкоз КРС).
  3. Необходимость фиксации животного.
  4. Стресс у животного, ведущий к потерям молока (более 5%).
  5. Осложнения после взятия крови; (гематомы, абсцессы).
  6. Взятая кровь – нестерильна (т.е. контаминирована).

 

Хранение проб крови и сыворотки крови:

Цельную кровь, плазму и сыворотку для непродолжительного хранения помещают в холодильник (+2…+4°С), длительное хранение сыворотки требует температуры – 20°С.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин при 20-30°С или 37-38°С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4-10°С 20-24 ч.

Отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки, закрывают пробками и направляют в лабораторию в течение первых суток и в исключительных случаях не позднее третьего дня после взятия крови.

Нарушение условий хранения проб может стать причиной погрешностей анализа. В результате длительного стояния сыворотки, над эритроцитами могут наступить сдвиги в концентрации ряда компонентов: повышается концентрация калия, активности кислой фосфатазы, аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, гидроксибутиратдегидрогеназы, понижается содержание глюкозы вследствие гликолитических процессов.

При температуре около 20°С в цельной крови возрастает содержание аммиака, многие ферменты даже при температуре холодильника быстро теряют свою активность (креатинкиназа, кислая фосфатаза), в лактатдегидрогеназа, напротив, быстрее теряет активность при низких температурах.  

Возникший при взятии или хранении гемолиз эритроцитов приводит к повышению концентрации калия, активности кислой фосфатазы, аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, гидроксибутиратдегидрогеназы.

Неумелое встряхивание проб при перемешивании их содержимого или при транспортировке также может вызвать гемолиз эритроцитов.

Сыворотка крови должна быть доставлена в лабораторию в течение первых суток и в исключительных случаях не позднее третьего дня после взятия крови.

 При пересылке сыворотки на большое расстояние, особенно летом, её необходимо консервировать 5%-ным раствором карболовой кислоты на физиологическом растворе из расчета на каждые 9 мл сыворотки 1 мл раствора карболовой кислоты или 1-2 капли раствора на 1 мл сыворотки.

Раствор карболовой кислоты необходимо подливать по каплям при постоянном встряхивании пробирки с сывороткой.

 Сыворотку или кровь можно консервировать также борной кислотой  (в порошке) из расчета 0,05-0,07 г  (на кончике скальпеля) на одну пробирку с кровью  (сывороткой).

На каждой пробе сыворотки или крови указывают ее номер или кличку животного или фамилию владельца животного.

Пробирки с кровью и сыворотками плотно закрывают стерильными пробками и устанавливают для пересылки в строго вертикальном положении.

Зимой сыворотки упаковывают и пересылают так, чтобы они не замерзли.

Пробы направляют с сопроводительной в двух экземплярах 

 

Взятие крови для гематологических исследований

 Кровь для гематологических исследований берут из ярёмной или каудальной (хвостовой) вены в специальные системы забора крови с антикоагулянтом или в пробирки с антикоагулянтами. В качестве антикоагулянтов используют трилон Б (ЭДТА-динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) из расчета 0,1 мл 10 %-ного раствора на 1 мл крови, гепарин (5ед. на 1 мл крови) или 6%-ный раствор лимоннокислого натрия (0,1 мл на 1 мл).

Для предотвращения свертывания крови содержимое пробирки сразу же тщательно перемешивают. Стабилизированную кровь до исследования хранят в холодильнике при температуре 2-40С и исследуют не позднее, чем через 36 часов с момента взятия.

Взятие крови для серологических исследований — ФГБУ «Брянская МВЛ»

15 апреля 2021, 10:13


 

Комментарий заведующей сектором серологии и биохимии диагностической лаборатории ФГБУ «Брянская МВЛ» Веры Малявко

На результат серологических исследований влияет целый ряд факторов: используемое оборудование, опыт специалистов и многое другое. Но первый и важный этап в обеспечении достоверных результатов лабораторных испытаний – это грамотный отбор проб.

Иглы перед взятием крови обязательно стерилизуют кипячением. Шерсть на месте взятия крови тщательно выстригают, а кожу дезинфицируют 70%-ным спиртом.

В настоящее время широко применяются вакуумные системы для забора крови. Такой способ удобен, безопасен и обеспечивает более точный результат анализов. В ветеринарии эти пробирки пользуются большим спросом, так как приходится обследовать крупный рогатый скот и других домашних животных каждый сезон.

Данная система для забора крови имеет несколько положительных моментов, которые облегчают работу ветврача. Система изготовлена так, что животное почти не чувствует боли (благодаря силикону на игле). Это важно, ведь чрезмерное возбуждение животного во время взятия крови (стресс) влияет на показатели кислотно-щелочного равновесия, сахара, гормонов, количество эозинофилов и лимфоцитов. В вакуумной пробирке кровь не контактирует с окружающей средой: она попадает туда в стерильных условиях (в классическом случае со шприцем больше вероятности попадания микробов в биологическую жидкость).

  • У лошадей, крупного рогатого окота, овец и коз кровь берут из яремной вены в верхней трети шеи.
  • У свиней кровь берут из уха (иглой со шприцем), из кончика хвоста, из передней полой вены.
  • У птиц кровь берут из подкрыльцовой вены или из гребешка.
  • У собак, кошек – из головной вены предплечья или латеральной подколенной голени.
  • Кровь у плотоядных — из вен конечностей.

Нужно следить, чтобы кровь стекала в пробирку струей, а не каплями. Кровь, взятая каплями и вспененная, скорее гемолизуется и часто дает неправильные результаты при исследовании.

Брать кровь для получения сыворотки надо по возможности утром, до кормления животных. Для серологического исследования берут по 7-10 мл крови от крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней; от пушных зверей и птиц по 1-2 мл.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин при 20-30 °С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей и ставят в термостат при температуре 37-38°С.

Отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки.

Пробирки с кровью и сыворотками плотно закрывают стерильными пробками и устанавливают для транспортировки в строго вертикальном положении. На каждой пробе крови или сыворотки указывают ее номер или кличку животного, или фамилию владельца животного.

Кровь направляют в лабораторию в термосе в течение первых суток и в исключительных случаях не позднее третьего дня после взятия крови. При отправке не допускают замораживания или сильного охлаждения крови, так как это приводит к гемолизу. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию не подлежат.

Еще раз стоит отметить, что объективные результаты исследований того или иного образца могут быть получены только при строгом соблюдении правил его отбора и транспортировки в лабораторию.

Получить подробную информацию о том, как доставить материал для исследований в лабораторию: Брянская область, Брянский район, с. Супонево, ул. Шоссейная 7, тел. 8(4832)32-23-30.

 

особенности, техники выполнения и ошибки

Лечебно-профилактические мероприятия в скотоводческой сфере требуют особого внимания и регулярности. Для этого выполняют периодический забор крови у КРС, чтобы проверить здоровье животного. От техники выполнения процедуры зависит качество исследования и будущая производительность племенного поголовья скота.

Как правильно подготовить животное

Кровь у коров берут на анализ для исследования ее биохимического состава. Это помогает исключить инфекционные болезни, подтвердить возможный диагноз ветеринара. Для этого нужна венозная кровь, которую проверяют на лейкоз, бруцеллез, туберкулез. Чтобы не травмировать сильно животное, важно правильно его подготовить к медицинской процедуре.

Обычно забор берут утром перед кормлением. После приема пищи нельзя брать анализ в течение 5 ч. Для серологического исследования берут по 7-10мл материала от КРС. Место для взятия пробы бреют электрической машинкой для стрижки коров для удаления волосяного покрова. Если нужно, то скотину предварительно фиксируют, а после участок нужно обработать антисептическим средством.

Иглы для забора материала должны быть с коротким срезом и достаточно большим диаметром, чтобы не повредить противоположную стенку вены, не вызвать повреждения эритроцитов. Перед использованием иглы нужно прокипятить в дезинфекционном кипятильнике.

Методики, которые не требуют фиксации животного, легче переносятся коровами. Любой стресс скажется на количестве удоя, а это принесет финансовые потери. Нельзя брать кровь у самок за 3 недели до отела или в течение этого же времени после родов. Чтобы не было проблем в будущем, соблюдайте технику забора крови, выбирая менее травматичный вариант для животного и самый безопасный для ветеринара.

Все популярные техники забора крови у скота

Взять кровь на анализ у животного можно из хвостовой, яремной и молочной вен. Процедура имеет свои особенности для каждой из зон, но все зависит от скорости и местоположения кровотока.

Из молочной вены

Она находится на животе коровы с 2-х сторон, сбоку от вымени. Лучше всего ее видно у взрослых особей. Этот вариант менее предпочтителен, так как у животного эта зона считается очень чувствительной. Плюс ко всему эта вена залегает более глубоко, чем это кажется на первый взгляд. Корову придется фиксировать, удерживать с разных сторон. А если нет специального оборудования, то для забора крови придется привлекать несколько человек.

Процесс проходит таким образом после удаления волос и обработки антисептиком:

  1. Прощупывают пальцами венозный бугорок.
  2. Вводят плавно иглу шприца параллельно поверхности кожи.
  3. Берут биологический материал.

Такая методика может быть травматичной для крупного рогатого скота, что скажется на удоях. Обычно фермеры стараются использовать другие методики.

Из яремной вены

Для этого используют кровопускательную иглу и стерильную пробирку, куда набирают биоматериал по стенке. Сосуд следует расположить к нижней трети шеи животного. Голову придется зафиксировать, что тоже является стрессом для коровы. Чтобы вызвать быстрое наполнение вены, уменьшить ее подвижность, кровеносный сосуд можно сдавить резиновым жгутом в середине шеи.

Техника следующая:

  • Зажимают большим пальцем сосуд на яремной вене.
  • Вводят иглу под острым углом в направлении 20–30° к поверхности кожи в направлении к голове. При этом глубина введения – 1 см.
  • Собирают нужное количество крови. Она должна стекать по стенке пробирки во избежание разрушения эритроцитов. При необходимости можно сразу смешивать жидкость с нужным количеством антикоагулянта.
  • Перед извлечением иглы из яремной вены снимают жгут, а вену пережимают пальцем выше места прокола.
  • После извлечения иглы место укола некоторое время сдавливают тампоном, чтобы не было гематомы.
  • После снова используем в обрабатываемой зоне дезинфицирующий раствор.

Материал в таких условиях считается нестерильным, а жидкость во время забора может разбрызгиваться.

К минусам этой методики можно отнести:

  • Большой риск распространения инфекции на ферме. Пострадают не только животные, но и люди. Это такие болезни как туберкулез, бруцеллез, лейкоз крупного рогатого скота.
  • Нужно фиксировать животное.
  • Будут осложнения после процедуры – гематома, абсцесс.
  • Стресс у скота, снижение удоев минимум на 5%.
  • Разбрызгивание крови, которая обязательно попадет на руки ветеринара, кормушку или др. объекты в хозяйстве.

В конце нужно добавить, что полученные пробы – нестерильные.

Из хвостовой вены

Такой метод отличается высокой скоростью забора биологического материала. Животное в этом случае фиксировать не нужно, а сама процедура легко переносится КРС. Последние методики в заборе крови как раз нацелены на взятие материала из хвостовой вены у коров.

Как проходит процедура:

  1. Берем хвост коровы на середине длины, а после – поднимает его вверх.
  2. Дезинфицируем спиртом область между 2 и 5 позвонком, а также прилегающую к ним зону.
  3. Берем стерильную иглу или систему для забора крови в 1 руку, а в другой держим хвост.
  4. Иглу нужно вводить перпендикулярно к поверхности хвоста, а глубина введения должна быть от 0,5 до 1 см.
  5. Делаем забор биоматериала.

Методика исключает контакт ветеринара с биоматериалом животного, а это является самым большим преимуществом. Трудности в заборе крови в сосуде создает слабый кровоток в этой части тела скота, но вакуумные системы помогают решить эту проблему. В результате процедура выходит эффективной и максимально безопасной.

В чем плюсы вакуумных систем

Применение вакуумных технологий для получения анализа помогает выполнить процедуру КРС максимально быстро и безопасно. Эта методика отлично работает на хвостовой вене. Процесс никак не травмирует скот, убирает прямой контакт ветеринара и животного с биологическим материалом.

Оборудование состоит из иглы и шприца с контейнером. Диаметр иглы обычно составляет 0,9 мм, она снабжается клапаном, который блокирует вытекание крови, а это снижает вероятность появления осложнений. Корпус шприца сделан из прочного пластика, само приспособление играет роль транспортного контейнера. В этой же емкости легко выделить сыворотку или добавить антикоагулянт.

Плюсы вакуумной системы:

  • Не нужно фиксировать скот.
  • Снижение стресса у животного.
  • Можно взять стерильную пробу.
  • Удобство использования, так как не нужно позже материал переливать в другую тару.
  • Нет прямого контакта ветеринара с биоматериалом.
  • Исключается риск разнесения инфекции среди поголовья скота.

Маркировка на таком изделии разрешает использование цветового кодирования, а это позволит сортировать полученные пробирки.

Какие могут быть ошибки

При выполнении обычной методики получения крови на анализ, например, из яремной вены скота, есть вероятность попадания материала на людей и окружающие вещи. Если скот заражен, то появляется риск расползания инфекции по ферме. При этом открытый способ отнимает много времени, требует определенной подготовки (минимум – фиксации животного), сноровки и предельной аккуратности.

Если нарушить нормы асептики и техники получения анализа у КРС, то готовый образец может не отвечать нужным требованиям. У коровы же могут появиться гематомы и абсцессы. Не нужно форсировать забор, так как произойдет частичный гемолиз кровяных клеток.

Как хранить пробу и сыворотку крови

Материал нужно поместить в холодильник при температуре +2…+4°С. Если придется длительное время хранить сыворотку, то нужна температура +20°С. Любое нарушение этих условий привлечет за собой погрешности в анализе. Неумелое встряхивание пробирок во время перемешивания их содержимого или в процессе транспортировки тоже вызывает гемолиз эритроцитов.

Сыворотку крови нужно направить на исследование в течение первых суток после взятия пробы, но не позже 3-го дня (в исключительных случаях). На каждой пробирке указывают номер, кличку животного, ФИО владельца коровы. Все пробы закрывают плотно стерильными пробками, ставят в вертикальное положение для пересылки. Зимой анализы нужно тщательно упаковать, чтобы при перевозке они не замерзли. Обязательно ветеринар, приглашенный на ферму для забора крови, готовит вместе с пробами сопроводительный документ в двух экземплярах.

Взятие крови у свиней — Лабораторные исследования


У свиней кровь берут из уха (иглой или шприцем) или из кончика хвоста. Хвост предварительно обмывают водой с мылом и дезинфицируют спиртом или 3%-ным раствором карболовой кислоты, а затем кончик отрезают ножницами. После взятия крови копчик хвоста обрабатывают йодом, перевязывают или прижигают.
Брать кровь надо по возможности утром, до кормления животных. Для серологического исследования от свиней кровь берут в количестве 7–10 мл
Взятую кровь выдерживают около часа при 30–35° для свертывания, а затем выносят в прохладное помещение. Для отстаивания. Через 10–12 часов отстоявшуюся сыворотку переливают в другие пробирки. Если сыворотка недостаточно отстоялась или верхний слой сгустка плотно прилегает к стенкам пробирки и отстаивание начинается снизу, то сгусток отделяют от стенок пробирки тонкой предварительно прокаленной и остывшей проволокой.
Сыворотка крови должна быть доставлена в лабораторию в течение первых суток и в исключительных случаях не позднее третьего дня после взятия крови.
При пересылке сыворотки на большое расстояние, особенно летом, ее необходимо консервировать
Для серологического исследования в лабораторию можно отправлять и цельную кровь, не отделяя сыворотку, но при условии, что в пути ее не будут встряхивать и она не подвергнется гемолизу.
На каждой пробе сыворотки или крови указывают ее номер или кличку животного или фамилию владельца животного. Пробы направляют с описью в двух экземплярах.
Пробирки с сыворотками плотно закрывают стерильными пробками и устанавливают для пересылки в строго вертикальном положении.
Зимой сыворотки упаковывают и пересылают так, чтобы они не замерзали.

Преаналитика лабораторного обследования в ветеринарии.

Интерес к лабораторному обследованию животных, в том числе, гематологическим исследованиям крови растет. Лабораторная диагностика в ветеринарии становится востребованной в связи с расширением предпочтений человека в выборе домашнего питомца. В тоже время, обследование и здоровье домашних животных является залогом здоровья хозяина.

Сбор крови у животных необходим с соблюдением антистрессовой технологии, при использовании в некоторых случаях, анестезии, специальных игл. Соблюдение технологии включает и обучение персонала.

Оценивая риски получения некачественного результата, необходимо помнить и о риске причинения вреда животному. Так, максимальный объем крови, допустимый для отбора у взрослого животного составляет от 55 до 70 мл/кг веса тела ( 2). Следует с осторожностью относиться к отбору крови у животных с ожирением и стареющих.

Дополнительно, важно соблюдать объем одномоентного рекомендуемого отбора крови (4):

• Кошка: 66 ml/kg • Собака: 86 ml/kg (USDA, 2013) • Мышь песчанка: 67 ml/kg (USDA, 2013) • Коза: 70 ml/kg (USDA, 2013) • Морская свинка: 75 ml/kg (USDA, 2013) • Хомяк: 78 ml/kg (USDA, 2013) • мышь: 80 ml/kg (USDA, 2013) • крыса: 64 ml/kg (USDA, 2013) • овца: 66 ml/kg (USDA, 2013) • свинья: 65 ml/kg • кролик: 62 ml/kg (USDA, 2013)

При одномоментном отборе у животного более 10% объема циркулирующей крови, потребуется замещающая инфузия жидкости. При отборе более 30% жидкости одномоментно, потребуется терапия для предотвращения гиповолемии (3).

Повторный отбор крови может быть выполнен через 3-4 недели. В случае необходимости повторного отбора в тот же день, допустимый максимум отбираемого объема составляет 0,6 мл/кг/день или 1,0% общего объема циркуляции крови животного.

Многократные повторные отборы крови, преимущественно, выполняются через установленную канюлю.

Область флеботомии выбирается в зависимости от животного:

Без анестезии:

  • Вена Saphenous vien – мыши крысы, морские свинки
  • Дорсальная Pedal vien – крысы. Мыши
  • С предварительной анестезией:
  • Хвостовая вена – крысы, мыши, крупный рогатый скот
  • Югулярная вена — крысы, мыши
  • Временная канюля – крысы, мыши
  • Установка катетера – крысы, морские свинки, хорьки
  • Tarsal vien – морские свинки
  • Краевая вена/артерия уха – кролики (иглы 20G)

Необходимо помнить, что допустимо максимум две попытки флеботомии для получения крови.

Пробирки для получения образца должны быть промаркированы до получения крови.

В современной лаборатории исследование образца выполняется на анализаторе. Учитывая особенности волосяного и кожного покрова животных, важно соблюдать аккуратность, удалить волосяной покров, если есть риск попадания в образец. Образец крови должен быть чистым и не должен содержать посторонних частиц, загрязняющих анализатор и вносящих интерференцию в результат.

В зависимости от размера животного используются различные размеры игл, от 20 до23G. Для домашних птиц используют иглы-бабочки.

У мелких животных кровь берут чаще шприцем, не создавая эффекта вакуума, во избежание коллапса вены.

Литература:

  1. Geering WA, Forman AJ, Nunn MJ Exotic Diseases of Animals, Aust Gov Publishing Service, Canberra, 1995, p.419-420
  2. Parasuraman S., Raveendran R., Kesavan R. Blood sample collection in small laboratory animals/ J Pharmacol Pharmacother 2010, 1(2):87-93
  3. Procedure for rabbit blood collection [online] Available from: http://www.research.uky.edu/ori/univet/resources/sop/Procedure_rabbit_blood_collection.pdf [Last cited on 2010 Feb 23]
  4. Institutional Animal Care and Use Committee Policy, Guidelines and Standard Operating Procedures/ Emory University, пересмотрено 02/05/2014 http://www.iacuc.emory.edu/policies/index.html

Ветеринарная клиника «Универсал», Правила подготовки и взятия анализов

На сегодняшний день использование лабораторных исследований в ветеринарной медицине распространено повсеместно. Однако, чтобы получить достоверные результаты, необходимо соблюдать правила сбора и доставки анализов в лабораторию.

  1. Клинический анализ крови –  кровь берется из вены, в стерильную пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. Голодная диета в случае этого исследования желательна, натощак около 10-12 часов. При взятии крови, она перемешивается аккуратно, без резких встряхиваний с антикоагулянтом. Объем крови необходимый для исследования указан на пробирке. Хранение материала производится при температуре +2…+8 С. В нашем центре клинический анализ делают сразу в течении 10-20 минут после взятия материала с выдачей результатов владельцам.
  2. Биохимический анализ крови —  кровь берется из вены, в стерильную пробирку с активаторами для образования сыворотки. Для проведения этого исследования требуется 10-12 часовая полная голодная диета. После взятия крови пробирка не более получаса отстаивается при комнатной температуре, затем кровь центрифугируется и сыворотку убирают в морозильную камеру до проведения исследования.  Непригодна для исследования сыворотка с гемолизом, хилезом, нарушением вязкости.
  3. Анализ мочи. Мочу необходимо  собирать в специальные стерильные пластиковые контейнеры, которые можно приобрести либо в человеческой аптеке, либо в ветеринарной клинике. Рекомендована 4 — х часовая голодная диета перед взятием мочи. У собак моча собирается при мочеиспускании, у кошек из лотка, предварительно вымытого. Также мочу можно собрать в стерильный шприц при катетеризации животного. Самый оптимальный метод — это взятие мочи непосредственно из мочевого пузыря путем цистоцинтеза (прокола мочевого пузыря через  брюшную стенку). В случае посева мочи — анализ берется только цистоцентезом.  Желательно доставить материал в лабораторию в течении получаса после взятия, если это невозможно, то ее охлаждают до 4 С и в течении 3 часов доставляют в лабораторию.
  4. Анализ кала. Кал собирается в сухой, чистый одноразовый контейнер, который можно приобрести в медицинский аптеках или в ветеринарных клиниках. Материал должен быть доставлен в лабораторию не позднее, чем 12 часов после дефекации. Перед сдачей анализа нежелательно проводить прием слабительных средств, вазелинового масла, активированного угля, клизмы и рентгенологическое исследование кишечника с применением рентгеноконтрастных веществ.
  5. Дерматофития. Материал собирается врачом. В данный профиль обследований входят соскобы с кожи, исследование шерсти, посевы. Для исследования собирают волосы, чешуйки и корки с периферии пораженного участка. Очаги исследования не должны подвергаться действию химических препаратов, то есть нежелательно приводить животное, которое обрабатывалось мазями или спреями в течении трех- четырех дней перед анализом.
  6. Эктопаразиты. При этом исследовании проводят глубокие ил и поверхностные соскобы кожи с целью обнаружения клещей. Соскобы могут проводят до  появления капиллярного кровотечения. После этого равномерно распределяют  на предметном стекле и отправляют в лабораторию. При этом обследовании, также нежелательно обрабатывать пораженные участки кожи химическими препаратами. Если обработки проводились, обязательно сообщите об этом врачу, который берет анализ.
  7. Серологические исследования (ИФА диагностика) – берется кровь в биохимическую пробирку . Голодная диета при этом виде исследования не требуется.
  8. Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) – техника проведения анализа зависит от возбудителя, ДНК которого необходимо выявить. Берется на исследование либо кровь, либо смывы с полостей и слизистых, либо субстраты (кал и т д). ПЦР диагностика помогает выявить наличие непосредственно вируса, то есть информативно в процессе его размножения в организме.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                Желаем здоровья вам и вашим питомцам!

Лабораторная диагностика — Ветеринарная клиника «В мире животных»

Биохимия крови

В нашей клинике запущен в работу биохимический анализатор. Теперь у нас есть возможность исследовать кровь у животных непосредственно в клинике. Время от забора крови до получения результатов исследования занимает не более часа.
Для чего же нужно проводить биохимическое исследование крови? Ответ об этом Вы узнаете ниже.

Для того чтобы получить полное представление о работе того или иного органа тела человека, уже не одно десятилетие успешно применяют метод биохимического анализа крови. В ветеринарной медицине этот метод диагностики также находит все большее применение.
Это один из способов лабораторной диагностики, который очень информативен для врача и отличается высокой степенью достоверности. Биохимический анализ крови не только раскроет полную картину функционирования того или иного органа, но и расскажет, испытывает ли организм недостаток в том или ином микроэлементе или витамине.
Биохимический анализ крови помогает поставить диагноз, назначить и скорректировать лечение, а также определить стадию заболевания.
В большинстве случаев, к биохимическому анализу крови следует подготовиться. Исключением могут быть экстренные случаи (шок, отравление и т.д.). Не рекомендуется давать животному корм в течение 6-12 часов перед исследованием. Воду можно пить.
Кровь берут чаще всего из периферических вен конечностей – подкожная вена предплечья, вена сафена, бедренная вена. Для биохимического анализа необходимо 5 – 10 мл крови.

Из крови получают сыворотку, и уже в сыворотке определяют содержание тех или иных веществ (белок, глюкоза, мочевина, билирубин и т.д.).
Результаты обычно известны в этот же день и выдаются на бланках, где указаны нормы каждого показателя с единицами измерения и полученный результат данного животного.

Общий клинический анализ крови

Общий клинический анализ крови (ОАК) – одно из наиболее часто используемых диагностических исследований. Он не требует специальной подготовки пациента. Удобство этого метода исследования – быстрота выполнения. На сегодняшний день в большинстве лабораторий данное исследование выполняется на автоматических анализаторах, что позволяет значительно сократить время проведения анализа и повышает его достоверность.
Проводя общий клинический анализ крови, врач оценивает общее состояние организма, состояние органов кроветворения. Забор крови у животных проводится из периферических вен конечностей.
С помощью клинического анализа крови можно оценить состояние лейкоцитов – белых кровяных телец. Лейкоциты отвечают за иммунитет человека и животных, их уровень может повышаться или понижаться при многих патологических состояниях. Учитывается соотношение отдельных групп лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, гранулоциты и др.). Каждая группа отвечает за определенные процессы в организме – аллергические реакции, вирусные или бактериальные инфекции, воспалительные процессы. Также количество отдельных клеток повышается в периоды выздоровления.
По состоянию красной крови (красные кровяные тельца — эритроциты, гемоглобин, гематокрит) можно выявить наличие анемии и определить ее тип, а в некоторых случаях и причину.
Также при проведении общего клинического анализа оценивают количество тромбоцитов – это клетки, отвечающие за свертываемость крови. При значительных изменениях количества этих клеток можно заподозрить нарушения свертывающей системы крови – вероятность образование тромбов или, наоборот, возникновение кровотечений. Для уточнения данных проблем специальными методами проверяют свертывающую систему крови.
Общий клинический анализ крови во многих с лучаях помогает поставить точные диагноз животному или оценить риски при проведении хирургических операций.

Экспресс-тесты

Экспресс-тесты для диагностики инфекционных болезней животных становятся все более популярными. Такая диагностика позволяет проводить лабораторные исследования в условиях клиники за очень короткий промежуток времени (от 5 до 30 минут). С помощью тестов можно подтвердить диагноз или исключить инфекцию, а также проверить уровень защиты организма иммунной системой.
Существует два вида тестов. С помощью одних мы выявляем наличие инфекционного агента – возбудителя болезни, с помощью других – проверяем наличие антител или их количество. Быстрый результат теста позволяет врачу уже на первом приеме поставить диагноз, озвучить прогноз владельцам и назначить соответствующее лечение животному.
Важно знать и помнить, что бывают ложноотрицательные результаты. Например, если тест выявляет наличие возбудителя. Инфекционный агент выделяется из организма не весь период болезни. Когда мы ищем возбудителя, мы берем тот материал, где возбудитель живет. Например, парвовирус (возбудитель парвовирусного энтерита собак и панлейкопении кошек) живет в кишечнике и выделяется с калом. Для теста мы возьмем мазок из прямой кишки. Выделяется вирус из организма с жидким стулом. Часто бывает так, что уже есть высокая температура, отказ от еды, рвота – т.е. болезнь уже началась, но тест будет отрицательный. Это связано с тем, что вирус уже вызвал поражение кишечника, но еще не начал выделяться с калом. Поэтому всегда важно ставить диагноз комплексно, не опираясь только лишь на данные теста. И через несколько дней желательно повторить тест.
Тест на наличие антител к какой-либо болезни тоже нельзя оценивать однозначно. Антитела – это специфическая защита организма. Появляются они в ответ на проникновение в организм инфекционных агентов (вирусов, бактерии). Отрицательный результат может быть в двух случаях – если организм никогда не сталкивался с возбудителем, или если антитела еще не успели сформироваться (на образование антител уходит от 7 до 14 дней после встречи с инфекцией). Положительный результат теста будет говорить о том, что организм сталкивался с данной инфекцией (или был вакцинирован против нее), но не обязательно, что в данный момент животное больно.
Тесты имеют очень важное диагностическое значение, но оценивать результаты можно только в комплексе с другими методами исследований, а также с учетом осмотра животного и рассказа владельца.

Сбор образцов крови у мелких лабораторных животных

J Pharmacol Pharmacother. Июль-декабрь 2010 г .; 1 (2): 87–93.

S Parasuraman

Департамент фармакологии, Институт последипломного медицинского образования и исследований Джавахарлала, Пондичерри, Индия

R Raveendran

Департамент фармакологии, Институт последипломного медицинского образования Индии Джавахарлала

R Kesavan

Отдел фармакологии, Институт последипломного медицинского образования и исследований Джавахарлала, Пондичерри, Индия

Отдел фармакологии, Институт последипломного медицинского образования и исследований Джавахарлала, Пондичерри, Индия

68 Адрес

для переписки: Парасураман С., Отдел фармакологии, Институт последипломного медицинского образования и исследований Джавахарлала, Пондичерри, Индия.Электронная почта: [email protected] Авторские права © Журнал фармакологии и фармакотерапии

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии наличия оригинала. работа правильно процитирована.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Сбор крови у мелких лабораторных животных необходим для широкого круга научных исследований, и для этого существует ряд эффективных методов.Важно, чтобы забор крови у экспериментальных животных был наименее стрессовым, поскольку стресс повлияет на результат исследования. Различные регулирующие органы и руководства ограничивают использование животных и методы сбора крови у лабораторных животных. В этой статье рассматриваются утвержденные методы сбора крови у лабораторных животных, таких как грызуны, зайцеобразные и негрызуны. Получено разрешение Комитета по этике животных института на использование животных для демонстрации техники.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ЗАБОРА КРОВИ У ЖИВОТНЫХ

  • Метод сбора крови должен быть описан в протоколе, утвержденном Комитетом по этике животных Института.

  • Это должно быть наименее болезненным и стрессовым. Образец крови можно собирать под анестезией [] или без анестезии. [1]

    Таблица 1

    Обычно рекомендуемые анестетики для экспериментов на лабораторных животных

    Виды животных Короткая анестезия Средняя анестезия Длительная анестезия
    Мыши Изофлуран (ингаляция) кетамин Ксилазин + кетамин
    Галотан (ингаляция) (5 мг + 100 мг i.м.) (16 мг + 60 мг в / б)
    Ксилазин + кетамин Ксилазин + кетамин
    (5 мг + 100 мг в / м) ( 16 мг +60 мг внутрибрюшинно) или
    Уретан (1200 мг / кг внутрибрюшинно)
    Морская свинка Изофлуран (ингаляция) Ксилазин + кетамин Ксилазин + кетамин
    (2 мг + 80 мг i.м.) (4 мг + 100 мг в / м)
    Кролики Изофлуран (ингаляция) Ксилазин + кетамин Ксилазин + кетамин
    (5 мг + 15-30 мг в / м) (5 мг + 100 мг в / м)
  • Для сбора крови любым методом у любых видов животных требуется соответствующая подготовка.

  • Обычно кровь берут из венозных, артериальных кровеносных сосудов или камер сердца.

  • Важна частота взятия крови. Раз в две недели идеально подходит для негрызунов. Если для исследования требуется несколько образцов крови, можно использовать зайцеобразных (например, зайцев и кроликов).

  • Весь нетерминальный забор крови без замены жидкости ограничен до 10% от общего объема циркулирующей крови у здоровых, нормальных взрослых животных за один раз, и сбор может быть повторен через 3-4 недели. Если требуются повторные пробы крови через короткие промежутки времени, максимум 0.6 мл / кг / день или 1,0% от общего объема крови животного можно отбирать каждые 24 часа. [2, 3]

  • Если исследование предполагает повторный сбор образцов крови, образцы могут быть взяты через временную канюлю. Это может уменьшить боль и стресс у экспериментальных животных.

  • Расчетный объем крови у взрослых животных составляет от 55 до 70 мл / кг массы тела. Следует проявлять осторожность с пожилыми животными и животными с ожирением. [4] Если объем сбора крови превышает более 10% от общего объема крови, может потребоваться восполнение жидкости.Раствор Рингера с лактатом (LRS) рекомендован Национальными институтами здравоохранения (NIH) как лучший заменитель жидкости. Если объем взятой крови превышает более 30% от общего объема циркулирующей крови, следует принять соответствующие меры, чтобы животное не страдало гиповолемией. [5]

ОБЩИЕ МЕТОДЫ СБОРА КРОВИ

Образцы крови собираются с использованием следующих методов: [1]

ПРОЦЕДУРА СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ САФЕННОЙ ВЕНЫ [9]

Требования включают: перчатки для работы с грызунами, полотенца, вату и животных, перчатки для работы с грызунами и пробы. пробирки для сбора и игла 20G.

  • Боковая подкожная вена используется для отбора проб с соблюдением правил асептики.

  • Задняя часть задней лапы сбривается электрическим триммером до тех пор, пока не станет видна подкожная вена. Также можно использовать крем для удаления волос.

  • Животное удерживают вручную или с помощью подходящего фиксатора для животных.

  • Задняя нога обездвижена, можно слегка надавить на коленный сустав.

  • Вена прокалывается иглой 20G и набирается достаточный объем крови с помощью капиллярной трубки или шприца с иглой.Место прокола сжимают, чтобы остановить кровотечение. При сборе крови:

    • местный обезболивающий крем можно наносить на место сбора

    • делается не более трех попыток

    • следует избегать непрерывного отбора проб и

    • сбора более четырех проб в день (24 -часовой период) не рекомендуется.

ПРОЦЕДУРА ЗАБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ В СПИННОЙ ПЕДАЛЬНОЙ ВЕЛЕ

Требования включают животных (крысы или мыши), перчатки для работы с грызунами, хлопок, капиллярную трубку, иглу 23G / 27G и пробирки для забора крови.

  • Животное содержится в фиксаторе.

  • Задняя стопа удерживается вокруг лодыжки, а медиальный дорсальный педальный сосуд находится на вершине стопы.

  • Стопу протирают абсолютным спиртом и прокалывают дорсальную вену педали иглой 23G / 27G.

  • Капли крови, которые могут появиться на поверхности кожи, собирают в капиллярную трубку, и прикладывают небольшое давление, чтобы остановить кровотечение [].

    Взятие образца крови из дорсальной педальной вены крысы

ПРОЦЕДУРА СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ИЗ ХВОСТОВОЙ Вены

Требования включают перчатки для работы с животными, грызунами, полотенце, хлопок, трубку для сбора образцов и камеру для подогрева животных.

  • Этот метод рекомендуется для взятия большого объема образца крови (до 2 мл / забор).

  • Животному комфортно в фиксаторе, поддерживая температуру около 24–27 ° C.

  • Нельзя тереть хвост от основания до кончика, так как это приведет к лейкоцитозу. Если жилки не видно, хвост опускают в теплую воду (40 ° С).

  • Крем для местной эстетики необходимо нанести на поверхность хвоста за 30 мин до эксперимента.

  • Игла 23G вводится в кровеносный сосуд, и кровь собирается с помощью капиллярной трубки или шприца с иглой. В случае затруднений от 0,5 до 1 см поверхности кожи разрезают и прокалывают вену кровоточащим ланцетом или иглой, а кровь собирают с помощью капиллярной трубки или шприца с иглой.

  • После завершения взятия крови накладывают мазь / раствор нитрата серебра для остановки кровотечения.

  • Если требуется несколько образцов, можно использовать временную хирургическую канюлю.

  • Сдерживающее средство часто моют, чтобы избежать / предотвратить стресс, вызванный феромонами, или перекрестную инфекцию [].

    Взятие образца крови из хвостовой вены мыши

ПРОЦЕДУРА СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ИЗ ХВОСТОВОГО СНЯТИЯ

Требования включают животное, анестетик, хлопок, хирургическое лезвие и пробирки для забора крови.

  • Этот метод рекомендуется для сбора крови только у мышей.

  • Этого метода следует избегать, насколько это возможно, поскольку он может привести к потенциально необратимому повреждению хвоста животного.При необходимости это следует делать только под терминальной анестезией.

  • Перед забором крови на хвост накладывают местную анестезию и с помощью лезвия скальпеля делают разрез на расстоянии 1 мм от кончика хвоста.

  • Кровоток останавливается прикосновением к кончику хвоста.

ПРОЦЕДУРА СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ИЗ ОРБИТАЛЬНОГО СИНУСА

Требования включают: животное, анестетик, хлопок, капиллярную трубку и пробирки для забора крови.

  • Этот метод используется с выздоровлением в экспериментальных условиях, и этот метод также называется кровотечением из периорбитального, заднеорбитального и орбитального венозного сплетения.

  • Образец крови взят под общим наркозом.

  • Местный офтальмологический анестетик наносится на глаз перед кровотечением.

  • Животное терзают большим и указательным пальцами не доминирующей руки и натягивают кожу вокруг глаза.

  • Капилляр вводится в медиальный угол спинки глаза (угол 30 градусов к носу).

  • Легкого давления большим пальцем достаточно, чтобы проколоть ткань и попасть в сплетение / пазуху.

  • После прокола сплетения / пазухи кровь пойдет через капиллярную трубку.

  • После взятия необходимого объема крови из сплетения капиллярную трубку осторожно удаляют и протирают стерильной ватой. Кровотечение можно остановить, слегка надавив пальцами.

  • Через тридцать минут после взятия крови животное проверяют на предмет послеоперационных и периорбитальных повреждений [Рисунки и].

    Забор крови из орбитального синуса крысы

    Забор крови из орбитального синуса мыши

  • Внимание:

    • Повторный забор крови не рекомендуется.

    • Требуется навык для сбора крови.

    • Даже незначительная ошибка может повредить глаза.

    • Между двумя кровотечениями должно быть две недели.

  • Побочные эффекты, о которых сообщалось при использовании этого метода, составляют от 1 до 2%, включая гематому, изъязвление роговицы, кератит, образование паннуса, разрыв глазного яблока, повреждение зрительного нерва и других внутриглазничных структур и некротический дакриоаденит хардерова. железа.

ПРОЦЕДУРА СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ЯГУЛЯРНОЙ ВЕНЫ

Требования включают животное, анестетик, хлопок, иглу 25G и пробирки для забора крови.

  • В этом методе нагревание животных не требуется и используется для сбора микрообъемов до 1 мл пробы крови.

  • Этот метод должен выполняться под общей / ингаляционной анестезией, и для взятия образца крови необходимы два человека.

  • Один человек должен удерживать животное и следить за ним.Другой человек должен взять образец крови у животного.

  • Область шеи животного сбривают и держат в чрезмерно вытянутом положении. Яремные вены кажутся синими и находятся на 2–4 мм латеральнее грудино-ключичного соединения. Игла 25G вводится в каудоцефальном направлении (назад вперед), и кровь выводится медленно, чтобы избежать коллапса этих мелких кровеносных сосудов. С животным следует обращаться осторожно, вводить в кровеносный сосуд не более 3–4 мм иглы.

  • Если попытка забрать кровь не удалась, иглу медленно удаляют и исследуют место кровотечения. Если кровотечения нет, можно сделать еще одну попытку. В случае кровотечения следует избегать дальнейших попыток, так как оно может разрушить вену.

  • Давление пальцем останавливает кровотечение.

  • Осторожно:

ПРОЦЕДУРА ВЗЯТИЯ ОБРАЗЦА КРОВИ С ВРЕМЕННОЙ КАНУЛОЙ

Требования включают: животное, анестетик, хлопок, иглу 25G, камеру для подогрева животных и пробирки для забора крови.

  • Обычно временная канюляция делается в хвостовой вене и используется в течение нескольких часов.

  • Животное удерживают и наносят крем местного анестетика на хвост (на 1-2 см выше кончика хвоста).

  • Хвост канюлирован или используется игла 25G.

  • При кровотечении из хвоста обычно требуется согревание животного для расширения кровеносных сосудов (37–39 ° C в течение 5–15 мин).

  • После канюляции животное должно быть помещено индивидуально в большие клетки.

ПРОТОКОЛ КАННУЛЯЦИИ СОСУДА

Требования включают животное, анестетик, хлопок, иглу 25G, в / в. канюля, хирургическое лезвие, гепарин (или любой антикоагулянт) и пробирки для забора крови.

  • Этот метод включает непрерывный и многократный отбор проб у экспериментального животного.

  • Этот метод требует тщательного и постоянного наблюдения за животным.

  • Обычно катетеризация кровеносных сосудов выполняется в бедренной артерии, бедренной вене, сонной артерии, яремной вене, полой вене и дорсальной аорте.

  • Для этого метода требуется хирургическое вмешательство, и следует использовать соответствующую анестезию и обезболивание, чтобы минимизировать боль.

  • После хирургической катетеризации животное должно содержаться отдельно в большой и просторной клетке.

  • Образец крови можно собирать в течение 24 часов в объеме от 0,1 до 0,2 мл / образец.

  • После забора крови канюлю промывают антикоагулянтом, а извлеченный объем можно заменить (при необходимости) на LRS, и канюлю следует плотно закрыть [].

    Канюляция кровеносного сосуда бедренной вены крысы

  • Осторожно: эксперимент должен проводиться с соблюдением всех правил асептики. Следует искать инфекцию, кровотечение, закупорку канюли и опухоль вокруг места канюляции. Размер иглы и максимальный объем крови, который необходимо забрать, указаны в.

    Таблица 2

    Размер иглы, используемой для канюляции кровеносных сосудов у разных видов животных

    Виды Игла, которая будет использоваться Максимальный объем сбора
    Мыши 23 — 25G 1 мл
    Крыса 19 — 21G 10-15 мл
    Кролик 19 — 21G 60-200 мл
    Морская свинка 20 — 21G 1-25 мл

ПРОТОКОЛ ДЛЯ СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ТАРСАЛЬНОЙ ВЕНЫ

Требования включают: животное, анестетик, хлопок, иглу 22G, средство для удаления волос и пробирки для забора крови.

  • На одной из задних ног крупных животных обнаружена предплюсневая жилка. Этот метод обычно рекомендуется для морских свинок.

  • Один человек должен правильно удерживать животное. Вены предплюсны могут быть видны синим цветом.

  • Поверхностные волоски удаляются подходящим средством для удаления волос. На место сбора наносится крем местного обезболивающего.

  • Через 20–30 минут медленно отбирают образец крови с помощью иглы 22G.

  • На каждую ногу можно взять максимум три пробы и от 0,1 до 0,3 мл крови на одну пробу.

  • После взятия пробы слегка надавите пальцем в течение 2 минут, чтобы остановить кровотечение [].

    Забор крови из предплюсневой вены морской свинки

  • Внимание:

ПРОТОКОЛ ДЛЯ СБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ИЗ КРАЕЧНОЙ ВЕНЫ / АРТЕРИИ

Требования включают: животное, анестетик, хлопок, иглу 26G, 95% об. Спирта, о-ксилол, хирургическое лезвие и пробирку для забора крови.

  • Этот метод обычно применяется для кроликов.

  • Животное следует поместить в ограничитель.

  • Ухо промывают 95% об. / Об. Спиртом и за 10 мин до отбора пробы наносят на место взятия крем местного анестетика. (При необходимости о-ксилол / вазодилататор для местного применения можно наносить местно на место сбора для расширения кровеносных сосудов).

  • Хирургическое лезвие размера 11 используется для разрезания краевой вены уха, а кровь собирается в пробирку для сбора.В противном случае для забора крови из маргинальной вены животного можно использовать иглу 26G.

  • После сбора крови на месте сбора помещают чистую стерильную вату и надавливают пальцами, чтобы остановить кровотечение [Рисунки и].

    Взятие образца крови из краевой вены уха кролика с помощью иглы 26 G

    Взятие образца крови из краевой вены уха кролика методом разреза.

ПРОТОКОЛ ДЛЯ СЕРДЕЧНОЙ ПУНКТУРА [10,11]

Требования включают животное, анестетик, полотенце, хлопок, иглу 19–25G со шприцем от 1 до 5 мл, хирургическое лезвие, трубку (внутренний диаметр 0.От 1 до 0,3 мм) для торакотомии, одноразового пластикового пакета и пробирок для забора крови.

  • В целом пункция сердца рекомендуется на завершающем этапе исследования для сбора однократного, хорошего качества и большого объема крови у экспериментальных животных.

  • Во время взятия пробы крови животное будет находиться под терминальной анестезией.

  • Соответствующая игла используется для взятия пробы крови с торакотомией или без нее. Образец крови будет взят из сердца, желательно из желудочка медленно, чтобы избежать коллапса сердца. [].

    Забор крови у крысы путем пункции сердца

  • Внимание: если у животного декстрокардия, взятие пробы может быть неудачным.

ПРОТОКОЛ ДЛЯ ЗАБОРА ОБРАЗЦОВ КРОВИ ЧЕРЕЗ ПОСТЕРИАЛЬНУЮ ВЕНУ

Требования включают животное, анестетик, хирургическое лезвие, маленькие стеклянные стержни, хирургические ножницы, иглу 21–25G со шприцем от 1 до 5 мл и пробирку для забора крови.

  • Как правило, для терминальной стадии исследования рекомендуется забор крови из задней полой вены.

  • Животное нужно анестезировать, сделать Y- или V-образный разрез на животе и аккуратно удалить кишечник.

  • Печень выдвигается вперед и определяется задняя полая вена (между почками).

  • Игла от 21 до 25G вводится для забора крови из задней полой вены.

  • Эта процедура будет повторяться три-четыре раза, чтобы собрать дополнительный объем образца крови.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сбор крови у экспериментальных животных — одна из важных процедур в биомедицинских исследованиях.Даже небольшая ошибка в процедуре сбора может привести к большим отклонениям в результатах.

Что следует помнить

  • Перед тем, как начать любой сбор образцов крови, необходимо убедиться, что на рабочем месте имеются все химические, хирургические и жидкостные потребности.

  • Не следует предпринимать более двух-трех попыток собрать любой биологический образец in vitro (за исключением биологического секрета).

  • Пробирка для забора крови должна быть промаркирована перед началом эксперимента, а проба крови должна быть собрана в соответственно промаркированную пробирку для забора крови.

Сноски

Источник поддержки: Нет

Конфликт интересов: Не заявлено

ССЫЛКИ

1. Hoff J, Rlagt LV. Методы взятия крови у мышей. Лабораторные животные. 2000; 29: 47–53. [Google Scholar] 4. МакГилл М.В., Роуэн А.Н. ILAR J. 1989. Биологические эффекты кровопотери: последствия для объемов и методов отбора проб; п. 31. [Google Scholar] 6. Руководство CPCSEA для помещений с лабораторными животными. Индийский J Pharmacol.2003. 35: 257–74. [Google Scholar] 7. Фогель Х.Г., редактор. Открытие и оценка лекарств: фармакологические тесты. 2-е изд. Берлин: Springer; 2002. [Google Scholar] 9. Hem A, Smith AJ, Solberg P. Пункция подкожной вены для забора крови мыши, крысы, хомяка, песчанки, морской свинки, хорька и норки. Lab Anim. 1998. 32: 364–8. [PubMed] [Google Scholar] 10. Паулозе С.С., Дакшинамурти К. Хроническая катетеризация с использованием порта для сосудистого доступа у крыс: забор крови с минимальным стрессом для определения катехоламинов в плазме.J Neurosci Methods. 1987. 22: 141–146. [PubMed] [Google Scholar] 11. Йобурн BC, Моралес Р., Inturrisi CE. Хроническая катетеризация сосудов у крысы: сравнение трех методов. Physiol Behav. 1984. 33: 89–94. [PubMed] [Google Scholar]

Руководство по взятию крови у лабораторных животных

НАЗНАЧЕНИЕ :

Этот документ представляет собой руководство для исследователей относительно безопасных объемов забора крови у обычных лабораторных животных. Все процедуры должны быть одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC).Используемый метод забора крови, интервалы между процедурами забора крови и объем крови, подлежащий забору, должны быть указаны в утвержденном протоколе для каждого исследования.

ИСТОРИЯ :

Метод и объем забираемой крови будут зависеть от вида животных, частоты сбора и экспериментальных потребностей. Исследователи должны планировать и выполнять каждый протокол отбора проб с учетом стрессов, связанных с потерей крови у животного, и делать все возможное, чтобы минимизировать реакцию животного на стресс.Тщательное планирование и контроль отбора проб крови и всех связанных с ним экспериментальных переменных должны не только способствовать благополучию животного, но и минимизировать искажающее влияние на данные исследования. (7)

Обучение и опыт человека в выбранной процедуре имеют решающее значение. Объем обучения и практики, необходимых для достижения заданного уровня компетентности в конкретной технике, варьируется от человека к человеку в зависимости, например, от ловкости рук, предыдущего опыта, отношения и навыков инструктора.

DLAR имеет ряд доступных учебных ресурсов.

Пожалуйста, свяжитесь с нашим координатором по обучению, чтобы получить подробную информацию или назначить сеанс.

РЕКОМЕНДАЦИИ:

Рекомендуемые объемы для сбора крови предназначены для сохранения состояния здоровья животного и подтверждения достоверности результатов экспериментов. Приведенные инструкции предназначены для здоровых, нормальных взрослых животных. Молодые, пожилые, находящиеся в стрессовом состоянии животные, подвергшиеся экспериментальным манипуляциям или страдающие сердечными или другими заболеваниями, могут быть не в состоянии переносить эти рекомендуемые отборы объема крови.

Объем:

В среднем общий объем циркулирующей крови составляет 5,5-8,0% от массы тела животного. Нетерминальный сбор крови без дополнительного мониторинга (см. Ниже) должен быть ограничен 10% от общего объема циркулирующей крови за один сбор или каждые 2 недели для серийных сборов.

Пример (с использованием приведенной ниже таблицы среднего объема крови): рассчитано, что кролик массой 4 кг имеет общий объем крови 224 мл (56 мл / кг x 4.0 кг). Таким образом, 22,4 мл (10% от 224 мл) можно собирать, не прибегая к замене жидкости один раз в две недели.

Расчетный общий объем крови и безопасный объем кровотечения у выбранных видов:

Виды Объем крови (мл / кг) Одно кровотечение —
макс. — 10% от объема крови (мл / кг)
Среднее значение Диапазон
Кот 55 55 5.5
Крупный рогатый скот 55 55 5,5
Цыпленок 60 60 6,0
Собака 86 86 (79-90) 8,6
Хорек 75 75 7,5
Лягушка 95 95 9,5
Песчанка 67 67 6.7
Коза 66 6,6
Морская свинка 75 75 (67-92) 7,5
Хомяк 78 78 7,8
Мини-свинка 65 65 (61-68) 6,5
Обезьяна
(Cynomolgous Macaque)
65 65 (55-75) 6.5
Обезьяна
(Макака-резус)
54 54 (44-67) 5,4
Мышь 79 79 (63-80) 7,9
Свинья 65 65 (61-68) 6,5
Кролик 56 56 (44-70) 5,6
Крыса 64 64 (58-70) 6.4
Овцы 66 66 (60-74) 6,6

Источник : адаптировано из формуляра для лабораторных животных, Hawk, Leary, and Morris 2005

Примечание: Если объем удаленной крови составляет 7,5% от общего объема крови, подождите 1 неделю для восстановления; если удалено 10%, подождите 2 недели; если удаленное количество составляет 15%, подождите 4 недели для восстановления.

Общие сайты для сбора крови:

Виды Рекомендуемые сайты и условия
Мышь Поверхностная височная вена (a.k.a., «подчелюстная» или «лицевая»), подкожная вена, хвостовая вена, ретроорбитальная (под наркозом), сердечная (под наркозом, терминальная)
Крыса Хвостовая вена, подкожная вена, поверхностная височная вена (также известная как «подчелюстная» или «лицевая»), сердечная (под наркозом, терминальная), подъязычная, яремная
Собака, кошка, примат, не являющийся человеком Головные, подкожные, бедренные и яремные вены
Морская свинка, Хомяк Подкожная вена, сердечная (под наркозом, терминальная)
Кролик Вена краевого уха сердечная (под наркозом, терминальная)
Свинья Яремная вена, вена уха
Голубь, Перепел Плечевая / крыловая вена
Цыпленок Плечевая / крыловая вена, яремная вена
Жвачные, лошадиные Яремная

Рекомендации для грызунов:

Аналогичным образом, примерно 10% объема циркулирующей крови можно безопасно удалять каждые 2–4 недели, 7.5% каждые 7 дней и 1% каждые 24 часа. Объемы, превышающие рекомендованные, должны быть научно обоснованы, и должна быть обеспечена соответствующая замена жидкости и / или клеток. Приблизительные объемы образцов крови для различных масс тела включены в таблицу ниже:

Масса тела (г) * CBV (мл) 1% CBV (мл)
каждые 24 часа **
7,5% CBV (мл)
каждые 7 дней **
10% CBV (мл)
каждые 2-4 недели **
20 1.10-1,40 0,011-0,014 0,082-0,105 0,11–0,14
25 1,37–1,75 0,014-0,018 0,10–0,13 0,14-0,18
30 1,65–2,10 0,017-0,021 0,12-0,16 0,17-0,21
35 1,93–2,45 0,019-0,025 0,14-0,18 0.19-0,25
40 2,20–2,80 0,022-0,28 0,16-0,21 0,22-0,28
125 6,88-8,75 0,069-0,088 0,52-0,66 0,69-0,88
150 8,25-10,50 0,082-0,105 0,62-0,79 0,82–1,00
200 11.00-14.00 0.11-0,14 0,82–1,05 1,10–1,40
250 13,75-17,50 0,14-0,18 1,00–1,30 1,40–1,80
300 16,50-21,00 0,17-0,21 1,20–1,60 1,70–2,10
350 19,25-24,50 0,19-0,25 1,40–1,80 1,90–2,50
* Объем циркулирующей крови ** Максимальный объем пробы для данной частоты дискретизации

Забор крови (рекомендации) | Исследования позвоночных животных

Рекомендации IACUC:

Сбор крови

Руководства: IACUC предоставил набор руководящих документов (Политики, Руководства и Информационные листы) для использования при планировании процедур с животными в Университете Айовы.Исключение из Руководства должно быть описано и обосновано в Протоколе о животных и утверждено в ходе обычного процесса проверки.

Назначение:

В этом документе содержатся указания и рекомендации по подходящим методам и объемам взятия крови у животных, используемых в исследованиях в Университете Айовы. Это руководство предназначено для использования квалифицированным персоналом, выполняющим сбор крови в соответствии с утвержденным IACUC Протоколом о животных.

При определении подходящего объема и техники взятия крови необходимо учитывать несколько факторов. К ним относятся:

  • Виды для отбора проб
  • Размер отбираемого животного
  • Возраст и состояние здоровья исследуемого животного
  • Минимальный объем, необходимый для анализа
  • Необходимая частота отбора проб
  • Обучение и опыт персонала, выполняющего сбор
  • Пригодность седации и / или анестезии

Выбранный объем пробы всегда должен быть минимальным объемом крови, удовлетворяющим потребности эксперимента.Следует использовать соответствующие средства сдерживания (физические или химические), чтобы свести к минимуму риск травм животного и персонала.

Методические указания по расчету инкассового объема:

  • Максимально допустимый объем крови включает кровь, потерянную во время сбора.
  • Как правило, 20 капель = 1 мл (т.е. 5 капель = 250 мкл)

Максимальные пределы сбора крови следующие:

  • Не более 1% массы тела животного за один сбор или в течение 24 часов
    • Например: 25 г мыши x 1% = 0.Максимальное удаление крови 25 мл или 250 мкл
  • Не более 1,5% массы тела животного в течение двух недель (14 дней)
    • Например: 200 г крысы x 1,5% = 3,0 мл максимум за 14 дней

Частые расчеты на грызунах

Виды

Масса

Максимальная кровопотеря за один раз / за 24 часа

Максимальная кровопотеря за 14 дней

Мышь

20 г

200 мкл

300 мкл

25 г

250 мкл

375 мкл

30 г

300 мкл

450 мкл

Крыса

200 г

2.0 мл

3 мл

250 г

2,5 мл

3,75 мл

300 г

3,0 мл

4,5 мл

Виды

Общий маршрут (ы) забора крови

Рекомендуется седация

Требуется анестезия

Мышь

Поднижнечелюстная вена

Хвостовая вена

Подкожная вена

Ретроорбитальный синус (см. Ниже)

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Крыса

Хвостовая вена

Подкожная вена

Яремная вена

Есть

Ретроорбитальное сплетение (см. Ниже)

Есть

Подъязычная вена

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Хорек

Головная вена

Подкожная вена

Яремная вена

Есть

Черепная полая вена

Есть

Кролик

Краевая вена уха

Центральная предсердная артерия

Подкожная вена

Есть

Яремная вена

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Хомяк

Подкожная вена

Головная вена

Яремная вена

Есть

Черепная полая вена

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Морские свинки

Вена уха (капля)

Подкожная вена

Черепная полая вена

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Песчанки

Боковая подкожная вена

Черепная полая вена

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Ксенопус

Дорсальная вена предплюсны

Есть

Сердечный (выживаемость)

Есть

Сердечные (невыжившие) (также головастики)

Есть

Голубь

Плечевая вена крыла

Есть

Собака, Кот

Головная вена

Подкожная вена

Яремная вена

Сердечный (невыживший)

Есть

Свинья

Вена уха

Есть

Черепная полая вена

Есть

Яремная вена

Есть

Сердечный (невыживший)

Есть

Жвачные животные

Яремная вена

Боковая подкожная вена

Хвостовая вена

Вена уха

Ограничение и анестезия при заборе крови:

Методы сдерживания и анестезия, используемые для сбора крови у подопытных животных, должны быть описаны и одобрены в протоколе для животных.Примеры удерживающих устройств включают удерживающие трубки для грызунов, хирургическое полотенце или декапиконы.

Гемостаз:

Обеспечение остановки кровотока (гемостаз) имеет первостепенное значение после взятия пробы крови. Для достижения гемостаза слегка надавите на место сбора крови, чтобы остановить кровотечение. Обычно используются рука в перчатке и кусок марли. Лучшая практика заключается в повторном осмотре животных примерно через 5 минут после возвращения в клетку, чтобы убедиться, что кровоток остановился.

Методы расширения хвостовой вены:

Для увеличения кровотока в хвостовой вене мыши или крысы можно использовать следующие методы:

1) Использование лампы обогрева *

2) Погружение хвоста в теплую воду (не выше 40 o C / 104 o F) *

3) Нанесение медицинского спирта на хвост

* Животные под нагревательной лампой должны находиться под непосредственным наблюдением, и необходимо проявлять осторожность, чтобы не допустить перегрева животного.Животные, которые перегреваются, могут показывать учащенное дыхание, снижение подвижности, покраснение конечностей и избегание использования тепловой лампы.

Ретроорбитальный отбор проб:

Забор ретроорбитальной крови у грызунов может дать кровь от умеренного до большого, если он проводится хорошо обученным персоналом. Однако, если эта процедура не будет выполнена должным образом, животное может получить серьезные травмы, и по возможности следует использовать доступные альтернативы.

Использование ретроорбитального кровотечения должно быть описано в протоколе и одобрено IACUC. Поскольку у крыс имеется венозное сплетение, а не синус (как у мышей), использование этого метода может привести к большему повреждению тканей, поэтому настоятельно рекомендуются альтернативные места сбора.

Если требуется ретроорбитальный сбор, применяются следующие правила:

  • Требуется общая анестезия
  • Для минимизации риска травм рекомендуется использовать пробирки для микрогематокрита вместимостью 50-75 микролитров
  • В любой момент можно взять пробу только из одного глаза
    • Если попытка забора из одного глаза не увенчалась успехом, можно использовать альтернативный метод, одобренный Протоколом о животных (e.грамм. поднижнечелюстной или подкожный путь) вместо повторной попытки ретроорбитального сбора из того же или противоположного глаза
  • Чередование левого и правого глаза за сеанс
  • Не более 1 сбора за 7 дней (поочередно). следовательно, 14 дней между сборами в одном и том же глазу
    • Исключение: если повторный отбор образцов в течение 8 часов необходим и одобрен Протоколом о животных, можно повторно взять образец ретроорбитального синуса путем разрушения сгустка крови (из исходного места сбора) без повторного повреждения синуса, при условии, что 24-часовой максимальный предел сбора крови не превышен
      • Проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом для демонстрации и обучения правильной технике для снижения риска травм
  • Максимум 3 процедуры на каждый глаз (всего до 6 коллекций)
  • Если в результате этого метода происходит травма и / или разрыв глаза или окружающих тканей, животное должно быть немедленно усыплено или проконсультироваться с ветеринаром OAR для получения рекомендаций

Применение местного офтальмологического анестетика во время / после сбора следует рассматривать для обеспечения постпроцедурной анальгезии.

Последний раз редактировал IACUC 08.01.2020

Влияние трех широко используемых методов взятия проб крови на благополучие лабораторных мышей: взгляд с точки зрения животных

Abstract

Лабораторные мыши — наиболее часто используемые животные в биомедицинских исследованиях. В соответствии с руководящими принципами гуманного обращения было разработано несколько методов взятия проб крови. Хотя влияние этих процедур на качество крови и гистологические изменения в месте отбора образцов хорошо изучено, их влияние на благополучие животных широко не исследовалось.Таким образом, наше исследование было направлено на сравнение трех часто используемых методов забора крови в отношении их влияния на различные показатели благополучия животных, включая параметры стресса физиологической и поведенческой реакции, включая показатели боли, поведение в домашней клетке и строительство гнезда, а также исследовательскую активность и неофобию. . Самцов мышей C57BL / 6J подвергали однократному забору крови либо из вены лицевой, , ретробульбарного синуса или хвостового сосуда, либо их распределяли для соответствующего контрольного лечения.Хотя все методы забора крови приводили к резкому повышению уровня кортикостерона в плазме, реакция была наиболее сильной у животных, которым проводили забор образцов из лицевой вены и ретробульбарного синуса. Аналогичные результаты наблюдались, когда динамику активности надпочечников контролировали с помощью метаболитов кортикостерона из образцов фекалий. Сбор крови из лицевой вены и ретробульбарного синуса также снизил поиск новых стимулов, привел к снижению активности по строительству гнезда и привел к более высоким баллам по шкале гримасы мыши.Более того, после кровотечения в лицевую вену сильно пострадали двигательная активность и поведение, связанное с тревогой. Интересно, что кровотечение из хвостового сосуда вызывает лишь незначительные изменения оцениваемых физиологических и поведенческих параметров. Важно отметить, что наблюдаемые эффекты во всех группах лечения больше не обнаруживались через 24 часа, что указывает только на краткосрочные воздействия. Таким образом, принимая во внимание точку зрения животного и всесторонне оценивая серьезность конкретных процедур отбора проб, результаты нашего исследования вносят свой вклад в Refinement в рамках концепции 3R и позволяют исследователям объективно выбирать наиболее подходящий и благоприятный для здоровья метод отбора проб крови для данный эксперимент.

Образец цитирования: Мейер Н., Крегер М., Тюммлер Дж., Титце Л., Пальме Р., Тома С. (2020) Влияние трех широко используемых методов забора крови на благополучие лабораторных мышей: взгляд с точки зрения животных. PLoS ONE 15 (9): e0238895. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895

Редактор: Александра Кавушанская, Израильский технологический институт Технион, ИЗРАИЛЬ

Поступила: 30 июня 2020 г .; Дата принятия: 25 августа 2020 г .; Опубликовано: 8 сентября 2020 г.

Авторские права: © 2020 Meyer et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Автор (ы) не получил специального финансирования для этой работы.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Лабораторные мыши — безусловно, наиболее широко используемые виды позвоночных в биомедицинских исследованиях [1]. В этой области исследований часто необходимо собирать образцы крови. Тем не менее, забор крови у мышей потенциально вызывает дистресс, может повлиять на здоровье и благополучие экспериментального животного и может исказить полученные результаты. Следовательно, по этическим и научным причинам применяемые методы взятия крови должны причинять как можно меньше боли и страданий мышам [2].

Соответственно, научные организации, такие как Society of Laboratory Animal Science и National Center for Replacement , Refinement & Reduction of Animals in Research , опубликовали рекомендации и руководства по часто используемым методам взятия проб крови у лабораторных мышей [3, 4]. Среди других методов для нетерминального сбора крови рекомендуется сбор крови из вены лицевого нерва (кровотечение из лицевой вены, FVB), ​​ретробульбарного венозного синуса (ретробульбарное кровотечение, RBB) и хвостовых сосудов (кровотечение из хвостового сосуда, TVB). [3–5].Однако эти методы сбора крови различаются по степени инвазивности, в первую очередь из-за необходимости анестезии или ограничения животного, а также из-за того, что продолжительность манипуляций может значительно различаться [6–9], что может привести к разной степени дистресса у животных.

Рассел и Берч предложили «3R» Replacement , Refinement и Reduction в 1959 году, чтобы минимизировать боль и страдания животных в биомедицинских исследованиях [10, 11].Чтобы сделать шаг к Refinement , касающемуся взятия проб крови у лабораторных мышей, наше углубленное исследование всесторонне изучило реакцию на стресс, вызванную тремя упомянутыми часто используемыми методами забора крови, с учетом также точки зрения животных. Более ранние исследования показали, что различные методы отбора проб влияют на качество пробы крови, изменяют несколько биохимических параметров и вызывают различное повреждение тканей в месте отбора проб [7, 12–18]. Однако объективная и научно достоверная оценка благополучия животных в ответ на стрессовые процедуры отбора проб является сложной задачей.Здесь несколько параметров, особенно в отношении спонтанного и естественного поведения, представляют ценную информацию [19–23], но часто игнорируются в исследованиях, оценивающих методы забора крови у лабораторных мышей.

Уже есть признаки того, что различные процедуры взятия проб крови могут привести к изменениям в спонтанном, а также экспериментально вызванном поведении, а также физиологических параметрах; однако результаты неоднозначны [17, 24–26]. Эти расхождения, вероятно, связаны с тем, что указанные исследования различаются деталями применяемой техники, а также частотой отбора проб крови и моментом времени после процедуры, когда оценивались физиологические и поведенческие изменения.Таким образом, по-прежнему необходимы надежные доказательства, чтобы дать обоснованные рекомендации относительно соответствующих и наиболее благоприятных для благополучия методов забора крови [27].

Таким образом, настоящее исследование было направлено на объективное и всестороннее сравнение трех широко применяемых методов взятия проб крови, описанных выше (TVB, RBB, FVB и соответствующие контрольные методы лечения), в отношении их острого и среднесрочного периода (т. Е. Через 24 часа после лечения). лечение) воздействия на лабораторных мышей. Для сбора подробной информации о возможном воздействии на различные параметры, связанные с благополучием, в четырех отдельных экспериментах были оценены различные физиологические и поведенческие индикаторы.Эти эксперименты были выполнены на самцах мышей C57BL / 6J, одной из наиболее широко используемых инбредных линий мышей в биомедицинских исследованиях и исходной линии для большинства генетически модифицированных моделей мышей [28, 29], то есть делая результаты актуальными для широкой области.

Учитывая кажущуюся разную степень инвазивности трех методов взятия проб крови, ожидались различия в секреции гормона стресса, то есть в уровнях кортикостерона в плазме и метаболитов кортикостерона в фекалиях [30, 31].Другими индикаторами ухудшения благополучия животных могут быть измененные спонтанные формы поведения [32], а также связанные с тревогой модели поведения в знакомой и новой среде [32–36], которые мы оценивали с помощью измерения активности в домашней клетке и стандартизированных поведенческих тестов, таких как Тест «Открытое поле», «Исследование новых объектов» и «Социальное взаимодействие». Более того, строительство и качество гнезд можно использовать как индикатор благополучия животных [20, 37–39], поскольку лабораторные мыши имеют высокую мотивацию строить гнезда, если им предоставляют соответствующий материал для гнезд [39].Чтобы выяснить, привели ли различные методы отбора проб крови к изменениям в построении гнезд, мы также оценили качество гнезд в нескольких острых и среднесрочных временных точках после процедуры отбора проб. В последнее время выражение лица грызунов использовалось для оценки параметров, связанных с благополучием [33, 34], как и у людей, мыши также демонстрируют так называемую гримасу боли [40]. Эти изменения в выражении лица, вызванные болью или стрессом, можно количественно оценить с помощью шкалы гримасы мыши (MGS), и повышенные оценки являются сильным индикатором ухудшения благополучия животных [40].Поэтому, с точки зрения животных, мы изучили, показывают ли мыши изменения в шкале MGS после различных методов забора крови. Мы выдвинули гипотезу о различном влиянии методов взятия проб крови на все эти показания, при этом более инвазивные методы приводят к наиболее сильным нарушениям по сравнению с контрольным лечением.

Методы

Животные

Молодые взрослые самцы мышей C57BL / 6J в возрасте от 10 до 12 недель были подвергнуты одному из трех различных методов взятия проб крови или двум контрольным обработкам в одном из четырех экспериментов (схематическое описание на рис. 1).Животных случайным образом распределяли в разные группы лечения. После расчета размера выборки a priori (G * Power, версия 3.0.10) мы стремились включить 12 животных на обработку и эксперимент, таким образом, всего было протестировано 240 животных. Отклонения от этого размера выборки вызваны потерями выборки или другими техническими проблемами. Фактические размеры выборки приведены на соответствующих рисунках и в таблицах. Мышей получали от коммерческого заводчика (Charles River, Sulzfeld, Germany) в возрасте трех недель и помещали в обычную систему содержания в клетках Marcolon с открытым верхом типа II long или Type III группами до пяти животных.Для экспериментальных целей и для того, чтобы избежать влияния иерархии доминирования на поведенческие и физиологические показатели, мышей индивидуально помещали в клетки Macrolon типа II за одну неделю до начала соответствующего эксперимента (эксперимент 1–4).

Рис. 1. Схематическая временная шкала четырех экспериментов.

Самцов мышей C57BL / 6J исследовали в четырех различных экспериментах (A – D). Лечение включает в себя один из трех методов забора крови (кровотечение из хвостовых сосудов (TVB), ретробульбарное кровотечение (RBB) или кровотечение из лицевой вены (FVB)) или одно из двух контрольных методов лечения (контроль обработки (HCO) или контроль анестезии (ACO). ).(A) В эксперименте 1 животных подвергали соответствующему лечению, и через 15 минут оценивали высвобождение гормона острого стресса. (B) В эксперименте 2 образцы фекалий животных собирали каждые 2 часа в течение 24 часов после обработки для оценки динамики активации оси HPA. Кроме того, измеряли потребление пищи и определяли массу тела, а также состояние шерсти в качестве показателей благополучия животных. (C) В эксперименте 3 мыши прошли три поведенческих теста (по 5 минут каждый) после соответствующего лечения, чтобы исследовать острые эффекты на двигательную активность и поведение, связанное с тревогой.Кроме того, оценивали острый (BS 15) и восстановление (BS 75) высвобождения гормона стресса. (D) В эксперименте 4 изучали острые эффекты соответствующего лечения на субъективное восприятие боли (MGS), поведение при строительстве гнезда и поведение в домашней клетке (день 2). Кроме того, оценивали среднесрочные эффекты на строение гнезда и поведение в домашней клетке, а также на двигательную активность и поведение, связанное с тревогой (день 3). Сокращения: BS — забор крови; BW — масса тела; CS — состояние шерсти; FI — прием пищи; ВК, дом-клетка; MGS, шкала гримасы мыши; НЕТ, испытание нового объекта; OF, тест открытого поля; SI, Тест социального взаимодействия.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.g001

Клетки меняли еженедельно, а корм (Altromin № 1324, Altromin GmbH, Лаге, Германия) и воду давали ad libitum . Если не указано иное, клетки были оборудованы подстилкой (LTE E-001, ABEDD Vertriebs GmbH, Вена, Австрия) и древесной стружкой (NBF E-011, ABEDD Vertriebs GmbH, Вена, Австрия) в качестве материала для гнездования, а с животными обращались с использованием метод обращения с хвостом. В жилых помещениях поддерживали цикл свет-темнота 12:12 (свет включался в 8 часов утра) с постоянной комнатной температурой 22 ± 2 ° C и относительной влажностью 55 ± 10%.Представленная работа соответствует действующим нормам, регулирующим эксперименты на животных в Германии и Европейском Союзе (Европейская директива 2010/63 / EU). Обо всех экспериментах было объявлено и одобрено Государственным управлением по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов Нижней Саксонии (LAVES, лицензия 19/3083) и «Специалистом по защите животных» Университета Оснабрюка.

Методы забора крови

Были применены три различных метода взятия проб крови, сравнивающих кровотечение из хвостовых сосудов (TVB), vena facialis кровотечение (FVB) и ретробульбарное венозное синусовое кровотечение (RBB).Кроме того, были включены две контрольные группы, то есть контроль обработки (HCO) и контроль над анестезией (ACO). Процедуры забора крови и контрольные обработки были идентичны для всех четырех экспериментов и подробно описаны ниже. Как правило, для всех процедур мышь транспортировалась в ее домашней клетке в соседнюю экспериментальную комнату, где проводился забор крови или контрольные обработки. Непосредственно перед любой из различных обработок мышей взвешивали (Опыт 2–4). Время от первого нарушения домашней клетки до помещения мышей обратно в клетки не превышало 3 минут для всех пяти экспериментальных групп.Первичный забор крови всегда проводился в первые часы световой фазы, то есть во впадине циркадного ритма кортикостерона [41, 42]. В рамках эксперимента все процедуры забора крови выполнялись одними и теми же обученными и опытными экспериментаторами.

Кровотечение из хвостового сосуда (TVB).

Мышь помещали на решетку из нержавеющей стали (крышку клетки), а хвост аккуратно фиксировали между пальцами экспериментатора. В остальном мышь могла свободно перемещаться.С помощью скальпеля делали небольшой горизонтальный разрез в нескольких сантиметрах от основания хвоста, надрезая вентральные сосуды хвоста [9, 43]. Кровь собирали с помощью микроволокон, покрытых ЭДТА (CB 300, SARSTEDT AG & Co. KG, Nürmbrecht, Германия), до максимального объема 150–250 мкл. При необходимости наносили легкие движения вверх от основания к разрезу для усиления кровотока. После сбора кровотечение останавливали, слегка надавливая на разрез ватным диском. После этого мышь помещали либо обратно в ее домашнюю клетку (Опыт 1), либо в метаболическую клетку (Опыт 2), либо в новую клетку для содержания (Опыт 3 и 4).Образцы крови хранили на льду до дальнейшей обработки.

Ретробульбарное венозное синусовое кровотечение (БПГ).

Мышь ненадолго анестезировали в стеклянной камере, используя смесь 5% изофлурана (Forene®, Abb.Vie GmbH & Co. KG, Германия) и окружающего воздуха. После потери рефлекса выпрямления (обычно примерно через 30 секунд) мышь вынимали из анестезиологической камеры и осторожно били за шею. Капилляр на 10 мкл (Hirschmann Laborgräte GmbH & Co. KG, Эберштадт, Германия, внешний диаметр 0.8 мм) вводили в медиальный угол глазной щели правого глаза с легким давлением и осторожным вращением капилляра. В пробирку с покрытием EDTA (1 мл; Kabe Labortechnik GmbH, Nümbrecht-Elsenroth, Германия) собирали не более 250 мкл крови. После сбора крови капилляр был осторожно удален, веко закрыто, и было приложено легкое давление с помощью ватного диска, чтобы минимизировать кровотечение. Мыши не проявляли никаких признаков сознания во время процедуры отбора проб. После этого мышь либо помещали обратно в ее домашнюю клетку (Опыт 1), либо в метаболическую клетку (Опыт 2), либо в новую клетку для содержания (Опыт 3 и 4), и выходили из наркоза (обычно в течение одной минуты). ) отслеживалось.Образцы хранили на льду до дальнейшей обработки.

Vena Facialis Bleeding (FVB).

Забор крови из лицевой вены был выполнен, как описано Golde и его коллегами [8]. Вкратце, мыши били за шею и ланцетом (5,0 мм; Solofix®, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Германия) прокалывали лицевую вену правой щеки. Кровеносный сосуд расположен примерно на 3–4 мм дорсально-каудально от безволосого пятна сбоку челюсти.Капли крови собирали с помощью микроволокон, покрытых ЭДТА (CB 300, SARSTEDT AG & Co. KG; Nürmbrecht, Германия). Кровотечение останавливали, слегка надавливая ватным тампоном на место прокола, а затем мышь помещали обратно в домашнюю клетку (Опыт 1), в метаболическую клетку (Опыт 2) или в новую клетку для содержания (Опыт 3). ). Было собрано не более 150–250 мкл крови, и образцы хранили на льду до дальнейшей обработки.

Анестезиологический контроль (ACO).

Для оценки воздействия ингаляционной анестезии, применяемой для БПН, была включена контрольная группа анестезии.Мышей лечили так же, как и в группе RBB, но без забора крови, т.е. животное помещали в камеру для анестезии, содержащую смесь 5% изофлурана (Forene®, Abb.Vie GmbH & Co. KG, Германия) и окружающего воздуха. . После потери рефлекса выпрямления (обычно примерно через 30 секунд) мышь удаляли из камеры и помещали либо обратно в ее домашнюю клетку (Опыт 1), либо в метаболическую клетку (Опыт 2), либо в новую клетку для удерживания ( Опыт 3 и 4) и контролировали выход из наркоза (обычно в течение одной минуты).

Система управления грузоподъемностью (HCO).

Поскольку манипуляция также может вызывать стрессовую реакцию, была включена контрольная группа манипуляций. Здесь мышей подвергали короткому периоду осторожного обращения, примерно 30 секунд, в течение которого мышей взвешивали. После этого мышь помещали либо обратно в ее домашнюю клетку (Опыт 1), либо в метаболическую клетку (Опыт 2), либо в новую клетку для содержания (Опыт 3 и 4).

Эксперимент 1 — Влияние на высвобождение гормона острого стресса

Чтобы исследовать влияние трех различных методов взятия проб крови и двух контрольных процедур на острую активацию оси HPA, мышей подвергали одной из пяти обработок, описанных выше.После возвращения мышей в их домашние клетки на 15 минут собирали второй образец крови для измерения концентраций кортикостерона в плазме. Для этого животных быстро умерщвляли декапитацией под изофлурановой анестезией и собирали кровь туловища в пробирки, покрытые ЭДТА (Kabe Labortechnik GmbH, Nümbrecht-Elsenroth, Германия), содержащие 10 мкл раствора ингибитора протеазы (1,54 мкМ апротинина, Carl Roth GmbH & Co.KG, Карлсруэ, Германия). Образцы хранили на льду до дальнейшей обработки.

Эксперимент 2 — Влияние на динамику активации оси HPA и поведенческие индикаторы, относящиеся к благополучию

Чтобы оценить влияние трех методов взятия проб крови на динамику активации оси HPA, животных помещали в так называемые метаболические клетки (клетки из нержавеющей стали, тип III, 38 x 22 x 15 см), снабженные бумажной лентой. полотенце в качестве материала для гнездования, чтобы помочь терморегуляции животных [подробнее см. 44, 45]. Мышей переводили в эти клетки уже за три дня до начала эксперимента, чтобы приучить их к новым условиям содержания и процедуре отбора проб фекалий [44, 45].После привыкания мышей подвергали одной из пяти обработок, описанных выше. В течение следующих 24 часов образцы фекалий собирали каждые два часа и хранили при -20 ° C до дальнейшей обработки [43, подробности см. В 44, 45].

Чтобы оценить влияние различных обработок на потребление пищи, количество пищи, потребляемой за 24 часа, измеряли для каждой мыши за день до соответствующей обработки и день после нее. Состояние шерсти животного оценивали непосредственно перед обработкой и через 24 часа.Состояние шерсти оценивали в соответствии с ранее опубликованными протоколами [подробнее см. 46, 47]. Вкратце, состояние шерсти представляло собой сумму баллов (0 = ухоженная, 1 = неопрятная), полученная по семи различным частям тела: голове, шее, спинной шерсти, брюшной части, основанию хвоста, передним ногам и задним ногам. После периода наблюдения в течение одной недели животных умерщвляли изофлурановой анестезией с последующей быстрой декапитацией.

Эксперимент 3 — Влияние на высвобождение гормона острого стресса и восстановление, а также влияние на двигательную активность, исследования и поведение, связанное с тревогой

Для дальнейшего изучения влияния различных методов взятия проб крови, вес тела оценивали накануне (-24 ч), непосредственно перед (0 ч) и через день после соответствующего лечения (24 ч).Двигательная активность и исследование поведения несоциальных и социальных стимулов, серия из трех тестов была проведена непосредственно после соответствующего лечения. Тесты «Открытое поле» (OF), «Новый объект» (NO) и «Социальное взаимодействие» (SI) проводились последовательно, каждый из которых длился пять минут. Таким образом, каждый тест служил привыканием к следующему тесту, то есть тест OF приучал животное к арене, на которую во время теста NO был помещен новый объект (проволочный держатель для карандашей). Тест NO служил для приучения животного к проволочному держателю для карандашей, под который помещали неизвестного самца сородича во время теста SI.Для изучения высвобождения гормона острого стресса и восстановления был взят образец крови сразу после теста SI (t = 15 мин) еще раз через 60 минут (t = 75 мин) с помощью TVB. Между этими двумя взятиями крови животных оставили в покое и оставили в своих домашних клетках в жилом помещении.

Поведенческие тесты.

OF, NO и SI выполнялись непосредственно друг за другом на одной и той же круглой испытательной арене (Ø 60 см, изготовлена ​​из черного ПВХ), при слабом освещении (приблизительно 15 люкс) и длились по пять минут каждая.В начале теста OF мышей помещали во внешнюю зону арены лицом к стене и позволяли исследовать новую среду в течение пяти минут. После этого животных ненадолго убрали с арены, а новый предмет (проволочный держатель для карандашей, 10 x 10 x 11 см (Д x Ш x В) DOKUMENT; Ikea, Германия, S1 Fig) поместили в центр арены для тест НЕТ. Животное вернули на арену, и ему разрешили исследовать теперь известную арену OF и новый объект в течение пяти минут.После этого мышь снова ненадолго удалили с арены. Для теста SI незнакомого самца мыши линии CD-1 (Crl: CD-1 (ICR)) помещали под проволочный держатель карандаша в качестве партнера по социальному взаимодействию. Это позволило установить обонятельный, зрительный и слуховой, но не физический контакт между подопытным животным и партнером по взаимодействию. Тогда мышка могла свободно исследовать арену и социального партнера в течение пяти минут. Все три поведенческих теста были записаны на видео с помощью цифровой видеокамеры, арена была разделена на внешнюю и внутреннюю зоны (Ø 30 см).Кроме того, в NO и SI зона взаимодействия определялась на расстоянии 2,5 см вокруг объекта / социального партнера. Общее пройденное расстояние, пройденное расстояние, количество заходов в каждую зону и время, проведенное в каждой зоне, автоматически регистрировались с помощью программного обеспечения для отслеживания ANY-maze (Stoelting Europe, Ирландия, версия 4.99). Вход засчитывался, когда не менее 80% тела мыши находилось в конкретной зоне (внутренней и внешней зоне) или когда голова входила в зону взаимодействия.После периода наблюдения в течение одной недели животных умерщвляли изофлурановой анестезией с последующей быстрой декапитацией.

Эксперимент 4 — Влияние на спонтанное поведение, восприятие боли и среднесрочные эффекты на двигательную активность, исследование и поведение, связанное с тревогой

Чтобы оценить спонтанное поведение в ответ на различные виды лечения, мы исследовали поведение в домашней клетке и активность по строительству гнезд. Более того, чтобы оценить восприятие боли мышами, изучали выражение их лиц с помощью шкалы гримас мыши (MGS).За неделю до этого эксперимента мышам дважды давали материал для гнезд (Nestlets), сделанный из прессованных хлопковых волокон (Ancare Corp., Беллмор, Нью-Йорк, США), чтобы познакомить их с этим новым материалом для гнездования. Более того, чтобы приучить подопытных животных к процедуре регистрации MGS, их помещали в коробки MGS (подробности см. Ниже) на три дня подряд по пять минут каждый. Ящики были сделаны из акрилового стекла с откидной крышкой (10 x 10 x 5 см (Д x Ш x В), S2, рис.).

Домашнее поведение в клетке.

Поведение в домашней клетке было изучено, чтобы выяснить, приводят ли различные методы забора крови или контрольные методы лечения к различиям в естественных и неспровоцированных моделях поведения. Для этого мышей регистрировали с помощью веб-камеры (Full-HD-webcam Besteker 1536P) в их домашних клетках (вид сбоку на клетку) при размещении на обычном месте в стойке для содержания. Поведение в домашней клетке оценивали в течение 60 минут каждый день за день до, сразу после соответствующих обработок и через 24 часа после этого.Поведенческий анализ проводился наблюдателем, слепым к лечению животных, с использованием программного обеспечения BORIS (версия 6.2.4) [48]. Описание оцениваемого поведения приведено в таблице 1.

Поведение при строительстве гнезд.

Строительство гнезд — это естественное поведение мелких грызунов, которое, как было показано, является показателем благополучия лабораторных мышей [49]. Мы оценили поведение при строительстве гнезда, используя баллы за строительство гнезда, описанные Диконом [37]. Вкратце, оценка от 1 до 5 присваивалась в зависимости от того, какая часть предоставленного Nestlet была измельчена и какая часть была использована для строительства гнезда.Оценка 1 означает, что более 90% Nestlet все еще не повреждено, а оценка 5 присваивается, когда более 90% Nestlet разорвано, и было построено гнездо со стенами (стены выше тела животных более 50% окружности гнезда) [37]. Строение гнезда оценивали утром непосредственно перед различными обработками (исходное значение). После обработки старый материал для гнездования был удален, и в домашнюю клетку животных поместили свежий Nestlet. В течение 10 часов подсчеты гнезд регистрировались каждые два часа, не беспокоя животных.Окончательная оценка гнезда была присвоена через 24 часа после соответствующей обработки. Подсчет очков всегда производился одним и тем же обученным наблюдателем, который не обращал внимания на лечение.

Шкала Гримасы Мыши (MGS).

Чтобы оценить, различается ли восприятие боли у экспериментальных животных после различных процедур, выражение их лиц было исследовано с использованием MGS. MGS был впервые описан Langford и соавторами [40] как мера субъективной боли у мышей. Вкратце, пять черт лица (единицы действия лица) были оценены как потенциальные показатели боли и были назначены три уровня интенсивности (0 = исходный уровень, 1 = умеренный, 2 = сильный).Сумма этих оценок составляет оценку MGS. Эти особенности включали сжатие орбитальной области, выпуклость носа, выпуклость щеки, положение уха и изменения положения усов [40]. Чтобы исследовать острые эффекты различных видов лечения, мы записывали на видео мышей в течение 5 минут в «MGS-боксах», описанных выше, сразу после соответствующего лечения. Из этих записей снимались скриншоты всякий раз, когда мышь обращалась к камере (Full-HD-веб-камера Besteker 1536P). Из этих изображений для оценки случайным образом были выбраны шесть изображений на мышь.Два независимых, обученных наблюдателя, которые не знали, как лечить животных, выполнили оценку, и их оценки были усреднены для определения окончательной оценки MGS. Следует отметить, что невозможно было надежно подсчитать «положение усов» блока действия, и поэтому оно было исключено из анализа. Следовательно, максимальный балл по MGS, которого могли достичь животные, составлял восемь.

Поведенческие тесты через 24 часа после лечения.

Чтобы исследовать возможные устойчивые (среднесрочные) эффекты различных видов лечения на двигательную активность и исследование новых объектов и социальных партнеров, мыши в эксперименте 4 прошли тот же набор поведенческих тестов (OF, NO, SI), как описано в эксперименте 3.Эти тесты проводились сразу после часовой записи поведения в домашней клетке на следующий день после лечения. После периода наблюдения в течение одной недели животных умерщвляли изофлурановой анестезией с последующей быстрой декапитацией.

Эндокринные анализы

Плазменный кортикостерон.

Уровни кортикостерона в плазме образцов крови, собранных в экспериментах 1 и 3, анализировали, как подробно описано в другом месте [43]. Вкратце, образцы крови центрифугировали в течение 10 минут при 4 ° C при 4000 g, а образцы плазмы анализировали с использованием коммерческого радиоиммуноанализа на кортикостерон (Rat / Mouse CORT 125 I RIA Kit, DRG Instruments GmbH, Марбург, Германия) или набор для ELISA кортикостерона (EIA 4164, DRG Instruments GmbH, Марбург, Германия).Все образцы были обработаны в соответствии с инструкциями производителя с небольшими изменениями, подробно описанными в [43]. Все стандарты, образцы и контроли были проанализированы в двух экземплярах. Коэффициенты вариации внутри и между анализами были ниже 10 и 12% соответственно.

Фекальные метаболиты кортикостерона (FCM).

Собранные пробы фекалий анализировали на иммунореактивный CM с использованием 5α-прегнан-3β, 11β, 21-триол-20-она EIA. Детали, касающиеся разработки, биохимических характеристик и физиологической валидации этого анализа, описаны Touma и его коллегами [44, 45].Более того, использованный ИФА оказался хорошо подходящим для обнаружения даже небольших изменений активности надпочечников у мышей [31, 45]. Перед анализом EIA образцы фекалий сушили при 80 ° C в течение двух часов. После этого их гомогенизировали и аликвоты по 0,05 г экстрагировали 1 мл 80% метанола. Подробное описание анализа было опубликовано в другом месте [44].

Статистический анализ

Для группового сравнения пяти обработок был проведен ANOVA (с поправкой Велча в случае неравной дисперсии), за которым следовало тестирование Bonferroni post hoc .ANOVA с повторными измерениями использовали для анализа динамики экскреции FCM. Чтобы соответствовать предположению о параметрическом анализе, остатки были исследованы с использованием скорректированного критерия Колмогорова-Смирнова Лиллиефорса. В случае, если данные не могли быть преобразованы для достижения нормального распределения (например, тест гнездования и поведение в домашней клетке), данные анализировались непараметрически, то есть с применением H-теста Краскела-Уоллиса для выявления значительных различий между различными группами лечения. В случае значительных различий было проведено апостериорных скорректированных по Бонферрони U-тестов Манна-Уитни.Тест Фридмана использовался как непараметрический тест для повторных измерений. Все данные были проанализированы с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics (версия 25.0). Графики были созданы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 7.01). Данные представлены как среднее значение + SEM. Для всех тестов различия считались достоверными, если р <0,05.

Результаты

Чтобы всесторонне оценить степень тяжести различных методов отбора проб крови, мы исследовали влияние трех методов отбора проб крови на прямые и косвенные показатели благополучия животных в четырех отдельных экспериментах: реакция на острый стресс (эксперимент 1) и ход стрессовой реакции (опыт 2).Кроме того, мы оценили острые и среднесрочные эффекты на двигательную активность и исследование новых объектов и социального партнера в поведенческой тестовой ситуации (эксперимент 3 и 4). Кроме того, были изучены острые и среднесрочные изменения в поведении в домашней клетке, строительстве гнезда и субъективном восприятии боли (эксперимент 4). В дополнение к трем группам отбора проб крови (кровотечение из хвостовых сосудов (TVB), ретробульбарное кровотечение (RBB) и кровотечение из лицевой вены (FVB)) мы включили две соответствующие контрольные группы (контроль обработки (HCO) и контроль анестезии (ACO)) в каждую. эксперимент (подробности в разделе «Методы»).

Три метода отбора проб крови по-разному влияли на выброс гормона острого стресса

В первом эксперименте (см. Схематическое описание на рис. 1A) мы исследовали реакцию гормона острого стресса, то есть, значительно ли различались ли группы лечения по уровням кортикостерона в плазме через 15 минут после соответствующего лечения. Действительно, мы обнаружили основной эффект лечения (F (4,55) = 13,727, p <0,001, рис. 2). По сравнению с группой HCO уровни кортикостерона в плазме были значительно увеличены у животных из ACO (p = 0.011), RBB (p <0,001) и FVB (p <0,001) группы. Интересно, что животные из группы TVB существенно не отличались от группы HCO (p> 0,05). Более того, мыши, которые подверглись только изофлурановой анестезии (ACO), показали значительно более низкий ответ кортикостерона в плазме, чем животные из группы RBB (p = 0,036). Кроме того, уровни кортикостерона в плазме были значительно ниже у животных, перенесших TVB, по сравнению с RBB (p = 0,003) и FVB (p = 0,018). Мыши из групп RBB и FVB показали самые высокие уровни кортикостерона в плазме и существенно не отличались друг от друга (p> 0.05).

Рис. 2. Уровни кортикостерона в плазме через 15 минут после забора крови или контрольной обработки.

Статистика: ANOVA; post hoc тестирование: Бонферрони, n = 12 на группу лечения. Значимые различия между группами обозначены разными буквами. Данные представлены в виде средних значений и SEM. Основные числовые данные рисунка доступны во вспомогательной информации (данные S1). HCO, управление погрузочно-разгрузочными работами; ACO — контроль анестезии; TVB, кровотечение из хвостового сосуда; БПБ, ретробульбарное кровотечение; FVB, кровотечение из вены лица.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.g002

Три метода отбора проб крови индуцировали разную степень активации оси HPA в течение нескольких часов

Во втором эксперименте (см. Схематическое описание на фиг. 1B), временной ход индуцированного стрессового ответа оси HPA был исследован путем мониторинга фекальных метаболитов кортикостерона (FCM) в течение 24 часов после соответствующих обработок. Образцы фекалий собирали с двухчасовыми интервалами.Все группы показали регулярные суточные колебания активности оси HPA в их уровнях FCM. Однако с помощью дисперсионного анализа с повторными измерениями был обнаружен значительный эффект времени * обработки (F (20,12, 276,64) = 2,517, p <0,001, поправка Гринхауса-Гейссера, рис. 3). При ожидаемой временной задержке для образцов фекалий [44, 45] основной эффект лечения был обнаружен через шесть часов (F (4,55) = 4,981, p = 0,002), восемь часов (F (4,55) = 12.200, p <0.001) и десять часов (F (4,55) = 5.116, p = 0,001) после забора крови или контрольной обработки (рис. 3). Post hoc анализы показали, что через 6 часов после FVB концентрации FCM были значительно выше, чем в группах HCO (p = 0,006) и ACO (p = 0,023). Через восемь часов после соответствующей обработки мыши из групп RBB и FVB показали значительно более высокие концентрации FCM по сравнению с HCO (RBB: p <0,001, FVB: p <0,001), ACO (RBB: p = 0,049, FVB: p = 0,002. ) и группы TVB (RBB: p = 0,022, FVB: p = 0,001).Через десять часов после соответствующих обработок концентрации FCM были все еще значительно выше у мышей, подвергшихся RBB и FVB, по сравнению с животными HCO (RBB: p = 0,049, FVB: p = 0,001).

Рис. 3. Метаболиты фекального кортикостерона, отслеживаемые в течение 24 часов после забора крови или контрольной обработки.

Образцы фекалий собирались с двухчасовыми интервалами. Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Статистика: ANOVA; post hoc тестирование: Бонферрони, n = 12 на группу лечения.Основной эффект лечения: * р <0,05. Через шесть часов после соответствующей обработки животные, перенесшие FVB, показали значительно более высокие значения по сравнению с HCO (p = 0,006) и ACO (p = 0,023). Через восемь часов после соответствующего лечения RBB и FVB значительно отличались от HCO (оба: p <0,001), ACO (p = 0,049 и p = 0,002, соответственно) и TVB (p = 0,022 и p = 0,001, соответственно). Через десять часов после соответствующего лечения RBB и FVB значительно отличались от HCO (p = 0,049 и p = 0.001 соответственно). Основные числовые данные рисунка доступны во вспомогательной информации (данные S1). HCO, управление погрузочно-разгрузочными работами; ACO - контроль анестезии; TVB, кровотечение из хвостового сосуда; БПБ, ретробульбарное кровотечение; FVB, кровотечение из вены лица.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.g003

Три метода взятия проб крови по-разному влияли на двигательную активность, исследование и поведение, связанное с тревогой, а также на острый и восстановительный уровни кортикостерона в плазме

В третьем эксперименте (см. Схематическое описание на рис. 1C) мыши прошли три различных поведенческих теста сразу после соответствующего лечения.В прямой последовательности животные выполняли тест открытого поля (OF), тест нового объекта (NO) и тест социального взаимодействия (SI), каждый из которых длился 5 минут. Эти поведенческие тесты сопровождались двумя измерениями уровня кортикостерона в плазме сразу после поведенческих тестов (t = 15, значение острого ответа) и 60 минут спустя (t = 75, значение восстановления). Эти два забора крови были выполнены с использованием метода TVB во всех пяти группах лечения.

Для анализа поведенческих данных были рассчитаны z-значений , объединяющие меры по одному и тому же поведенческому измерению [50].Мы интегрировали «пройденное расстояние» для всех трех поведенческих тестов в качестве меры локомоторной активности (z-оценка локомоции, рис. 4A). Кроме того, использовалась мера «поведения, связанного с тревогой», включающая задержку входа, время, проведенное в зоне взаимодействия, количество входов в зону взаимодействия и время, проведенное во внешней зоне в тестах NO и SI (z — оценка тревожности, рис. 4В). Основной эффект лечения был обнаружен для обоих z-значений (z-оценка локомоции: F (4,46) = 6,516, p <0.001 и z-оценка тревожности: F Уэлча (4,22,33) = 6,730, p = 0,001). В то время как локомоция в целом снижалась после соответствующего лечения по сравнению с группой HCO, группа FVB показала значительно сниженную двигательную активность по сравнению со всеми другими группами лечения и контрольной группой (FVB против HCO: p = 0,001, FVB против ACO: p = 0,002, FVB против TVB: p = 0,046, FVB против RBB: p = 0,006; рис. 4A).

Рис. 4. Двигательная активность и тревожное поведение сразу после забора крови или контрольного лечения.

Z-баллы были рассчитаны для передвижения (A) и тревоги (B) в тестах «Открытое поле», «Новый объект» и «Социальное взаимодействие». Статистика: ANOVA с тестом Велча в случае неравных дисперсий; post hoc тестирование: Bonferroni или Games-Howell в случае неравных отклонений. Значимые различия между группами обозначены разными буквами. n (HCO) = 10, n (ACO) = 10, n (TVB) = 9, n (RBB) = 11, n (FVB) = 11. Данные представлены в виде средних значений и SEM. Основные числовые данные каждого рисунка доступны во вспомогательной информации (данные S1).HCO, управление погрузочно-разгрузочными работами; ACO — контроль анестезии; TVB, кровотечение из хвостового сосуда; БПБ, ретробульбарное кровотечение; FVB, кровотечение из вены лица.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.g004

Что касается z-балла для поведения, связанного с тревогой (рис. 4B), после БПН и FVB животные показали значительно более высокие уровни поведения, связанного с тревогой, по сравнению с животным HCO (Games-Howell post hoc : RBB vs HCO: p = 0,005, FVB vs HCO: p = 0,044). Более того, у мышей, получавших RBB, наблюдалось значительно повышенное поведение, связанное с тревогой, по сравнению с группой ACO (Games-Howell post hoc : p = 0.014). Эти эффекты больше не обнаруживались через 24 часа после различных обработок (протестировано на другой группе животных, см. Опыт 4, z-баллы локомоции: F (4,44) = 0,719, p = 0,343, z-баллы беспокойства: F (4,44) = 1,129, p = 0,355). Данные и статистический анализ различных параметров, количественно измеренных в трех поведенческих тестах для немедленных и среднесрочных эффектов, можно найти в таблицах S1 и S2.

Что касается измерений кортикостерона в плазме, как для значения острого ответа, так и для значения восстановления был обнаружен значительный основной эффект лечения (F (4,46) = 20.549, p <0,001 и F Уэлча (4, 21,81) = 27,688, p <0,001; Рис 5). Острый ответ кортикостерона в плазме был самым низким у животных HCO по сравнению со всеми другими группами (Bonferroni post hoc : ACO: p = 0,001, TVB: p = 0,001, RBB: p <0,001, FVB: p <0,001; рис. 5). В дополнение к показателям значительно более высоких уровней кортикостерона, чем у животных HCO, мыши, перенесшие FVB, также показали значительно более сильное увеличение уровней кортикостерона в плазме по сравнению с ACO (p = 0.002) и TVB (p = 0,003) животных. Значения восстановления снова были значительно ниже в группе HCO по сравнению со всеми другими группами (Games-Howell post hoc ACO: p = 0,002, TVB: p = 0,002, RBB: p <0,001, FVB: p <0,001; рис. 5). . Более того, по сравнению с группами ACO и TVB, животные, перенесшие RBB или FVB, показали значительно более высокие уровни кортикостерона (Games-Howell post hoc : RBB против ACO: p = 0,007, RBB против TVB: p = 0,010, FVB против ACO. : p <0,001, FVB против TVB: p = 0.001; Рис 5).

Рис. 5. Исходный (0 мин), острый (15 мин) и восстановительный (75 мин) уровни кортикостерона в плазме после соответствующего лечения.

Исходные значения существенно не различались между группами лечения. Значительная разница (* p <0,05) была обнаружена между группами лечения по уровню кортикостерона в остром периоде и по уровню восстановления. Острые уровни были значительно ниже у животных HCO по сравнению со всеми другими группами (ACO: p = 0,001, TVB: p = 0,001, RBB: p <0,001, FVB: p <0.001). Кроме того, животные, перенесшие FVB, значительно отличались от групп ACO (p = 0,002) и TVB (p = 0,003). Значения восстановления были значительно ниже в группе HCO по сравнению со всеми другими группами (p = 0,002, TVB: p = 0,002, RBB: p <0,001, FVB: p <0,001). Более того, группы ACO и TVB значительно отличались от групп RBB или FVB (Games-Howell post hoc : RBB vs ACO: p = 0,007, RBB vs TVB: p = 0,010, FVB vs ACO: p <0,001, FVB vs TVB: р = 0,001). Статистика: ANOVA с тестом Велча в случае неравных дисперсий; апостериорное тестирование: Bonferroni или Games-Howell в случае неравных отклонений; в точке отбора проб «0» n (TVB) = 9, n (RBB) = 10, n (FVB) = 10; в точке отбора проб «15» n (HCO) = 10, n (ACO) = 10, n (TVB) = 9, n (RBB) = 12, n (FVB) = 11; в точке отбора проб «75» n (HCO) = 10, n (ACO) = 10, n (TVB) = 9, n (RBB) = 11, n (FVB) = 10.Данные представлены как средние ± стандартная ошибка среднего. Основные числовые данные рисунка доступны во вспомогательной информации (данные S1). HCO, управление погрузочно-разгрузочными работами; ACO - контроль анестезии; TVB, кровотечение из хвостового сосуда; БПБ, ретробульбарное кровотечение; FVB, кровотечение из вены лица.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.g005

Три метода взятия проб крови резко повлияли на строительство гнезда, восприятие боли и поведение в домашней клетке

В четвертом эксперименте (см. Схематическое описание на рис. 1D) мы оценили строящееся гнездо поведение мышей, подвергшихся разному лечению, с использованием протокола тестирования гнезд, описанного Диконом [37].Кроме того, мы применили шкалу гримасы мыши (MGS) [40] для оценки поведения, связанного с болью, и исследовали изменения в поведении животных в домашней клетке.

Качество гнезда оценивалось непосредственно перед соответствующим лечением (исходное значение), в течение 10-часового курса (с двухчасовыми интервалами) сразу после лечения (острые эффекты) и снова через 24 часа после лечения (среднесрочные эффекты). Исходные оценки гнезд не различались между пятью различными группами лечения (H-критерий Краскела-Уоллиса: χ 2 = 1.947, df = 4, p = 0,763; Рис 6). В течение десяти часов сразу после экспериментальных обработок во всех группах наблюдалось значительное увеличение количества гнезд со временем (критерий Фридмана: χ 2 = 30,715–38,321, df = 6, p <0,001; рис. 6). Сравнение обработок в разных точках отбора проб выявило значительную разницу через четыре часа после соответствующей обработки (χ 2 = 16,422, df = 4, p = 0,003). Животные из групп RBB и FVB достигли значительно более низких баллов за строительство гнезда по сравнению с мышами, перенесшими ACO (RBB: p = 0.023, FVB: p = 0,038, U-критерий Манна-Уитни с поправками Бонферрони). Тем не менее, через 24 часа не было зарегистрировано никаких значительных различий в оценках гнезд между группами лечения (H-критерий Краскела-Уоллиса: χ 2 = 2,269, df = 4, p = 0,714), и большинство мышей достигли 4 баллов. или 5, аналогично базовым значениям (рис. 6).

Рис. 6. Влияние отбора проб крови или контрольной обработки на поведение при строительстве гнезд.

Качество гнезд оценивали до (момент времени 0) и после соответствующей обработки.Сразу после обработки был предоставлен новый Nestlet, и качество гнезд оценивалось каждые 2 часа в течение 10 часов и снова через 24 часа. Качество гнезда может достигать значений от 1 (низкое качество гнезда) до 5 (превосходное качество гнезда) [37]. Значительная разница (* p <0,05) в качестве гнезд между группами была обнаружена через 4 часа после соответствующей обработки. Животные, перенесшие БПН и FVB, значительно отличались от животных группы ACO (RBB: p = 0,023; FVB: p = 0,038). Статистика: H-тест Краскела-Уоллиса, за которым следует post hoc (U-критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони), в момент времени «0»: n = 8 на группу; во все другие моменты времени n (HCO) = 10, n (ACO) = 10, n (TVB) = 10, n (RBB) = 10, n (FVB) = 9.Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Основные числовые данные рисунка доступны во вспомогательной информации (данные S1). HCO, управление погрузочно-разгрузочными работами; ACO — контроль анестезии; TVB, кровотечение из хвостового сосуда; БПБ, ретробульбарное кровотечение; FVB, кровотечение из вены лица.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.g006

Чтобы оценить субъективное восприятие боли животными, выражение их лиц оценивалось в течение 5 минут сразу после соответствующего лечения с использованием шкалы MGS. протокол [40].Здесь был обнаружен основной эффект лечения (Welch’s F (4,20,41) = 9,127, p <0,001; рис. 7). Тестирование Post hoc выявило значительно более высокие показатели MGS для мышей, перенесших ACO, FVB или RBB, по сравнению с группой HCO (Games-Howell post hoc : p = 0,004, p = 0,030 и p = 0,015, соответственно). В то время как животные, перенесшие TVB, существенно не отличались от групп HCO и FVB (Games-Howell: p = 0,813 и p = 0,056), была обнаружена значительная разница в баллах MGS по сравнению с ACO (p = 0.014) и RBB (p = 0,036) группы. Группы ACO, RBB и FVB существенно не отличались друг от друга (ACO vs RBB p = 0,466, ACO vs FVB p = 0,338, RBB vs FVB p = 0,973).

Рис. 7. Влияние забора крови или контрольного лечения на восприятие боли по шкале гримас мыши (MGS).

Четыре различные черты лица (сжатие орбиты, выпуклость носа, выпуклость щеки и положение уха) оценивались в соответствии с изменениями по сравнению с исходным уровнем (0 = без изменений, 1 = умеренное, 2 = тяжелое) [40]; таким образом, максимальный балл, который можно было набрать, составил 8.Статистика: ANOVA с тестом Велча; post hoc тестирование: Games-Howell. Значимые различия между группами обозначены разными буквами. n (HCO) = 10, n (ACO) = 9, n (TVB) = 9, n (RBB) = 10, n (FVB) = 9. Данные представлены в виде средних значений и SEM. Основные числовые данные рисунка доступны во вспомогательной информации (данные S1). HCO, управление погрузочно-разгрузочными работами; ACO — контроль анестезии; TVB, кровотечение из хвостового сосуда; БПБ, ретробульбарное кровотечение; FVB, кровотечение из вены лица.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0238895.g007

Чтобы оценить влияние забора крови на естественное поведение животных в домашней клетке, мы проанализировали их активность в течение 60 минут в трех временных точках: 24 часа до и сразу после и через 24 часа после соответствующей обработки. В день перед забором крови и контрольными обработками животные существенно не различались по поведению в домашней клетке (см. Таблицу S3). В день забора крови, однако, были обнаружены значительные различия между группами лечения по нескольким типам поведения (см. Таблицу 2): время, потраченное на уход за шерстью, значительно различалось между группами лечения и контрольной группой (χ 2 = 11.598, df = 4, p = 0,021). Post hoc тестирование показало, что мыши, перенесшие FVB, показали значительно большую заботу по сравнению с мышами из группы HCO. Кроме того, экспериментальная и контрольная группы значительно различались по количеству подъемов (χ 2 = 14,61, df = 4, p = 0,006). Животные из группы FVB показали значительно меньшее количество вставок на корточки по сравнению с мышами ACO (p = 0,018). Более того, мы наблюдали значительную разницу во времени, в течение которого животные находились в неподвижном состоянии, выражая сгорбленную позу (χ 2 = 26.058, df = 4, p <0,001). Такое поведение почти исключительно продемонстрировали животные, перенесшие FVB, и в меньшей степени мыши из группы RBB (FVB против HCO: p <0,001, FVB против ACO: p <0,001, FVB против TVB: p <0,001, FVB против RBB. : p = 0,015). Более того, время, затрачиваемое на строительство гнезд, значительно зависело от различных обработок (χ 2 = 9,726, df = 4, p = 0,045), однако эффект был недостаточно сильным, чтобы быть значимым в апостериорном исследовании . анализ.

Интересно, что через день после взятия пробы крови все еще была обнаружена значительная разница в поведении при строительстве гнезда (χ 2 = 9,902, df = 4, p = 0,042). В данном случае апостериорный анализ показал, что мыши, перенесшие FVB в предыдущий день, проводили значительно меньше времени на строительство гнезда по сравнению с мышами из группы RBB (p = 0,037) (см. Таблицу S3).

Три метода отбора проб крови не повлияли на массу тела, состояние шерсти и прием пищи

Масса тела, потребление пищи и состояние шерсти были оценены как дополнительные показатели благополучия животных.В целом, масса тела животных не изменилась после взятия проб крови или контрольной обработки ни в одном из экспериментов (эксперимент 2–4, см. Таблицу 3).

Кроме того, состояние шерсти мышей не различалось между группами обработки непосредственно до и через 24 часа после соответствующей обработки (см. Таблицу S4). Точно так же потребление пищи, измеренное за 24 часа до и после соответствующего лечения, существенно не различалось между группами лечения (см. Таблицу S5).

Обсуждение

Настоящее исследование было направлено на изучение влияния трех широко используемых методов взятия проб крови у мышей в отношении их влияния на благополучие животных.Применяя строгий дизайн в обширной серии экспериментов, мы могли показать, что действительно, один забор крови с помощью этих трех методов по-разному влиял на физиологию стресса и поведение животных, вызывая различные степени стресса, влияя на параметры, важные для благополучия животных. оценка. Эти воздействия кажутся более сильными после FVB и RBB. Таким образом, наши результаты подчеркивают, что TVB более благоприятны для здоровья животных, чем два других применяемых метода.

Хотя масса тела, состояние шерсти и потребление пищи существенно не различались между пятью группами лечения, был обнаружен значительный ответ кортикостерона (рис. 2, 3 и 5). Во всех группах наблюдалось повышение уровня кортикостерона в плазме по сравнению с исходным уровнем. Значения реакции через 15 минут после соответствующей обработки были самыми низкими в контрольной группе и группе TVB. FVB и RBB показали наиболее резкое увеличение, а также более медленное восстановление / длительную активацию, о чем свидетельствуют все еще повышенные уровни кортикостерона в плазме через 75 минут после лечения (рис. 5).Поскольку уровни глюкокортикоидов в плазме являются индикатором величины стрессовой реакции [51], эти результаты показывают, что лабораторные мыши испытывают более тяжелые стрессовые воздействия на FVB и RBB, чем на TVB или контрольную терапию. Несмотря на то, что анестезия изофлураном сама по себе вызвала более сильную стрессовую реакцию, чем манипуляция, одна анестезия не могла объяснить существенное увеличение, наблюдаемое у животных, перенесших БПН, поскольку эти две группы значительно отличаются друг от друга. Эти результаты дополнительно подтверждаются анализом метаболитов фекального кортикостерона (рис. 3).Метаболиты кортикостерона, выделяемые через восемь-десять часов после воздействия раздражителя, отражают активность оси HPA в ответ на этот стрессорный фактор [44, 45]. Действительно, уже через шесть часов после соответствующей обработки животные, подвергшиеся FVB, имели значительно более высокие уровни FCM по сравнению с животными HCO. Через восемь часов этот эффект был еще более выраженным: лечение FVB и RBB привело к значительно более высоким уровням по сравнению с контролем обработки, контролем анестезии и TVB. Через десять часов RBB и FVB значительно отличались от контрольного.Исходя из этого, можно сделать вывод, что забор крови из вены лица и ретробульбарного венозного синуса является значительно более стрессовым по сравнению с TVB, HCO и ACO. Эти результаты согласуются с результатами, полученными другими группами [18, 24, 52, 53]. Например, Мадетоя и его коллеги смогли показать, что самки мышей, перенесшие кровотечение из хвостовых сосудов, показали более слабое повышение уровня кортикостерона в плазме по сравнению с образцами из лицевой вены и подкожной вены [52].Аналогичным образом, другие исследования показали, что необузданные ножницы из хвоста приводили к более низким уровням кортикостерона в плазме по сравнению с анестезированным ножом из хвоста и ретроорбитальной пункцией [53], а концентрации кортикостерона в плазме были выше после БПН и сублингвальной пункции по сравнению с ампутацией кончика хвоста [18]. Другие исследования не обнаружили этих эффектов [17, 54, 55]. Например, Gjendal и его коллеги исследовали концентрации FCM с помощью нескольких методов взятия проб крови, включая RBB и FVB у самок мышей.Хотя они не обнаружили значительного увеличения, это, вероятно, связано с тем, что в их исследовании образцы были объединены в течение 24 часов после лечения, а не собраны в более короткие промежутки времени, т.е. . В других исследованиях расхождения с нашими результатами, вероятно, связаны с различиями в процедурах забора крови, например, согреванием хвоста и сдерживанием животного для TVB [17]. Однако, когда требуется лишь небольшое количество крови, эти дополнительные меры не нужны при применении TVB.

В соответствии с различиями, обнаруженными в уровнях кортикостерона и FCM в плазме, животные, перенесшие FVB и, в меньшей степени, RBB, показали глубокие изменения в своем поведении (как в экспериментальной среде, так и в домашней клетке). В целом, после FVB, мыши показали снижение двигательной активности и снижение интереса к новым объектам или социальным партнерам, что продемонстрировано тестами «Открытое поле», «Новый объект» и «Социальное взаимодействие» (рис. 4, таблицы S1 и S2). После БПН был обнаружен аналогичный эффект на поиск новых стимулов, и мыши, казалось, избегали центра аппарата.Однако общая двигательная активность не была снижена у животных группы RBB. Интересно, что это измененное поведение больше не наблюдалось 24 часа спустя. Эти результаты показывают, что, хотя FVB и RBB изменяют двигательную активность и исследование, это острые эффекты, которые, по-видимому, не имеют средне- или долгосрочных последствий.

Острое снижение двигательной активности также соответствует нашим наблюдениям в домашних клетках с животными, где мышей оставляли в покое, и их поведение регистрировали в течение одного часа.Хотя общая локомоция не различалась между группами лечения, поразительным было наблюдение, что некоторые мыши долгое время оставались неподвижными в сгорбленной позе (т. Е. Низко сутулились с увеличенной кривизной спины, их уши были отведены назад, конечности втянуты под туловище. ). Такое поведение почти исключительно проявлялось у мышей, перенесших FVB, и в гораздо меньшей степени — у мышей, перенесших RBB. Эта поза рассматривается как индикатор боли и стресса у мышей [56–58] и оказывает существенное влияние на благополучие животных.В исследовании, сравнивающем сбор крови путем разреза хвостовой вены, ампутации кончика хвоста или пункции лицевой вены, также было показано, что в течение 10 минут после сбора крови FVB приводил к увеличению частоты бездействия (т. Е. Как минимум 15 секунд неподвижности или замораживание) эпизодов [26]. Здесь мы показали, что повышенная пассивность наблюдается также у животных, перенесших БПН.

Более того, мыши из группы FVB показали значительно больше ухода в домашней клетке, чем у контрольных мышей, что могло быть связано с шероховатостью шеи и ощущением боли в черепно-лицевой области, которую испытала группа FVB.Если посмотреть на динамику строительства гнезд в течение 24 часов, становится очевидным, что FVB и RBB показали более низкие оценки гнезд, то есть снижение качества гнезд, через четыре и шесть часов после соответствующей обработки. После этого оценки гнезд больше не различались. Высокая степень активности по строительству гнезд может быть интерпретирована как признак того, что все потребности животных удовлетворены, и наоборот, когда строительство гнезд сокращается, как показатель снижения благосостояния [20, 37, 39]. Это еще одно свидетельство того, что FVB и RBB влияют на благополучие мышей, так как гнезда, которые они построили в первые часы после забора крови, были значительно худшего качества.В других исследованиях различные методы забора крови, например, неограниченный отрезок хвоста, кровотечение из хвостового сосуда, ретробульбарное кровотечение и кровотечение из лицевой вены, не приводили к различиям в поведении при строительстве гнезда. Однако в этих исследованиях качество гнезда оценивалось через 10 часов [26] или 24 часа [54] после забора крови, что согласуется с нашими выводами, поскольку мы аналогичным образом не увидели значительных различий в течение 6 часов после обработки. Кроме того, время интеграции гнездового материала в уже существующее гнездо, по-видимому, увеличивается после хирургического вмешательства [59], что еще раз подтверждает наши выводы.Напротив, другое исследование могло показать, что строительство гнезд было одинаковым между контролем и лечением FVB и значительно уменьшалось после TVB и RBB [25]. Одно из объяснений этого несоответствия может заключаться в том, что для сбора крови из хвостового сосуда мышей в этом исследовании физически удерживали в контейнере. Хотя это ограничение не зафиксировано, оно может вызвать более высокую степень дистресса, чем простое удерживание мыши за хвост, как это сделано в нашем исследовании. Более того, Харикришнан и его коллеги использовали иглу для FVB, а не ланцет [25].Однако, поскольку другие исследования не обнаружили различий в поведенческих показателях после использования ланцета или иглы [7], это объяснение является умозрительным.

Если посмотреть на результаты MGS (рис. 7), также очевидно, что FVB и RBB, по-видимому, вызывают наиболее сильный стрессовый ответ у экспериментальных мышей. Первоначально MGS был разработан для оценки боли, но он также отражает стрессовое воздействие [40, 60]. Показатели MGS были самыми высокими у мышей, перенесших FVB и RBB, и это единственные виды лечения, которые значительно отличались от контрольной группы.Однако нельзя исключить, что наблюдаемые различия были вызваны манипуляциями в области лица во время FVB и RBB. Тем не менее, лечение проводилось только на одной стороне лица, в то время как обе стороны наблюдались для оценки MGS; поэтому мы считаем, что этот потенциальный эффект минимален и не ставит под полную угрозу измерения MGS. Интересно, хотя и не значимо, животные, перенесшие TVB, показали более низкие баллы по MGS по сравнению с мышами ACO. Похоже, что одно только кратковременное воздействие анестезии влияет на выражение лица у мышей C57BL / 6J.Эти результаты согласуются с сообщениями о штаммах-специфических эффектах на показатели MGS после воздействия изофлурана [61]. Интересно, что другие исследования обнаружили более выраженные эффекты у самок мышей, но не у самцов мышей после однократной и многократной анестезии изофлураном [60], однако однократная и многократная анестезия кетамином и ксилазином давала значительно более высокие результаты у самцов и самок мышей [62].

Взяв вместе изменения в поведении, вырисовывается четкая картина, что забор крови из лицевой вены и, в меньшей степени, из ретробульбарного синуса приводит к изменениям, связанным с благополучием, которые обычно отражаются в снижении активности мышей.Такие изменения в образцах активности у мышей обсуждаются как признаки дистресса [33, 63]. Подобно нашим открытиям, мыши, перенесшие флеботомию лицевых вен, также показали снижение поведения, связанного с движением колеса, — поведенческой активности, недавно предложенной в качестве инструмента для оценки степени тяжести у лабораторных мышей [64].

В целом, становится очевидным, что методы отбора проб, которые выполняются в лицевой области (RBB, FVB) животного, оказывают более неблагоприятное воздействие на поведение и физиологию стресса мышей.Эти результаты можно объяснить более высокой степенью инвазивности этих методов, т. Е. Вытирания шваброй и анестезии в дополнение к пункции вены. Другим объяснением может быть восприятие боли. У людей боль, испытываемая в области лица, обычно оценивается как более сильная по сравнению с болью в теле, а черепно-лицевая боль качественно отличается от экстракраниальной ноцицепции [65]. Недавно было показано, что это может иметь место и у грызунов [66]. Следовательно, забор крови в черепно-лицевых областях у мышей может вызвать более сильную аффективную боль, чем забор крови из других частей тела, например.грамм. хвост.

Заключение

В совокупности данные, представленные в нашем исследовании, предоставляют достаточные и исчерпывающие доказательства того, что три широко применяемых метода взятия проб крови (TVB, RBB, FVB) по-разному влияли на животных. Уже однократный забор крови с использованием FVB привел к глубоким изменениям параметров физиологического и поведенческого стресса, связанным с ухудшением благополучия животных. БОР привел к аналогичным результатам в том же направлении. Эти эффекты были очевидны сразу после соответствующих курсов лечения (т.е. в первые часы после забора крови), но через 24 часа уже не обнаруживались, что указывает на краткосрочное воздействие. Интересно, что TVB оказал наименьшее влияние на животных и в большинстве случаев даже не вызывал значительного отклонения от контрольной группы обработки. Следовательно, если требуются только относительно небольшие объемы крови (до 150 мкл) и качество образца крови (сбор с поверхности кожи) не влияет на биохимические показатели, согласно нашим результатам, TVB является наиболее благоприятным для здоровья животных. дружелюбная техника.Таким образом, принимая во внимание точку зрения животного и всесторонне оценивая серьезность конкретных процедур отбора проб, результаты нашего исследования вносят важный вклад в Refinement в рамках концепции 3R. Это позволяет исследователям объективно выбирать наиболее подходящий и благоприятный для благополучия способ забора крови для конкретного эксперимента.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Новый объект.

Проволочный держатель для карандашей (10 x 10 x 11 см (Д x Ш x В), DOKUMENT; Ikea, Германия), который используется в качестве нового объекта в тесте исследования новых объектов.Во время теста социального взаимодействия незнакомая мышь помещается внутрь (Опыт 3 и 4).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.s002

(TIF)

S2 Рис. Шкала гримасы мыши.

Для исследования острого воздействия различных методов лечения на болевую гримасу в Exp. 4, мышей помещали в коробки шкалы Mouse Grimace Scale из акрилового стекла (10 x 10 x 5 см (Д x Ш x В) и закрывали крышки. Затем мышей записывали на видео в течение 5 минут.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0238895.s003

(TIF)

S1 Таблица.

Непосредственное влияние различных методов взятия проб крови или контрольных процедур на поведение в тесте «Открытое поле» (A), «Новый объект» (B) и социальное взаимодействие (C). Данные представлены в виде средних значений и SEM. Жирный шрифт указывает на статистически значимые различия между группами (p <0,05; однофакторный дисперсионный анализ). Средства с разными надстрочными буквами существенно отличаются друг от друга (p <0.05, Bonferroni post hoc ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.s004

(DOCX)

S2 Таблица.

Среднесрочные эффекты различных методов взятия проб крови или контрольных процедур на поведение в тесте «Открытое поле» (A), «Новый объект» (B) и «Социальное взаимодействие» (C). Данные представлены в виде средних значений и SEM. Жирный шрифт указывает на статистически значимые различия между группами (p <0,05; однофакторный дисперсионный анализ). Средства с разными надстрочными буквами существенно отличаются друг от друга (p <0.05, Bonferroni post hoc ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.s005

(DOCX)

S3 Таблица.

Выражение спонтанного поведения в домашней клетке, проанализированное в течение 60 минут, за 24 часа до (A) и через 24 часа после (B) соответствующей обработки. Данные представлены в процентах от времени (более 60 минут), за исключением выращивания, которое представлено как частота (#). Данные представлены как среднее ± SEM. Полужирный шрифт подчеркивает существенные различия между методами лечения (p <0.05, df = 4; H-тест Краскела-Уоллиса (KWH)). Средние с разными надстрочными буквами значительно отличаются друг от друга ( post hoc, U-критерий Манна-Уитни, скорректированный по Бонферрони, p <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.s006

(DOCX)

S4 Таблица. Показатели состояния шерсти мышей непосредственно перед соответствующим лечением и через 24 часа после него (максимальное количество баллов из семи).

Изображено среднее значение ± SEM. Между группами лечения не было обнаружено значительных различий (p> 0.05, df = 4 H-критерий Краскела-Уоллиса (KWH)).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238895.s007

(DOCX)

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эдит Клобец-Рассам, Аню Ритц и Надин Судхоф за их отличную техническую помощь.

Ссылки

  1. 1. Малакофф Д. Расцвет мыши, модельного млекопитающего в биомедицине. Наука. 2000. С. 248–253. pmid: 10777401
  2. 2. Европейский Союз.Директива 2010/63 / EU Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых в научных целях. Off J Eur Union. 2010; L276: 33–79.
  3. 3. Общество лабораторных зоотехник. Информация специалистов Комитета по защите животных (GV-SOLAS) и Рабочей группы 4 в Рекомендации TVT по забору проб крови у лабораторных животных, особенно у мелких лабораторных животных. 2017. Доступно: http://www.gv-solas.de/fileadmin/user_upload/pdf_publikation/Tierschutzbeauftragte/tie_blutentnahme17_e.pdf
  4. 4. Национальный центр улучшения замещения и сокращения животных в исследованиях. Мышь для забора крови | NC3Rs. Доступно: https://nc3rs.org.uk/blood-sampling-mouse
  5. 5. Мортон Д.Б., Эббот Д., Барклай Р., Клоуз Б.С., Эубанк Р., Гаск Д. и др. Удаление крови у лабораторных млекопитающих и птиц: первый отчет совместной рабочей группы BVA / FRAME / RSPCA / UFAW по очистке. Lab Anim. 1993; 27: 1–22. pmid: 8437430
  6. 6. Хофф Дж.Методы взятия крови у мышей. Лаборатория Аним (Нью-Йорк). 2000; 29: 47–53.
  7. 7. Франциско СС, Ховарт Г.С., Уиттакер А.Л. Влияние на благополучие животных и качество образцов 2 методов взятия крови из лицевой вены мышей. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2015; 54: 76–80. pmid: 25651095
  8. 8. Голд В.Т., Голлобин П., Родригес Л.Л. Быстрый, простой и гуманный метод подчелюстного кровотечения у мышей с помощью ланцета. Лаборатория Аним (Нью-Йорк). 2005; 34: 39–43. pmid: 16195737
  9. 9.Dürschlag M, Wurbel H, Stauffacher M, Von Holst D. Повторный сбор крови у лабораторных мышей с помощью разреза хвоста — модификация старой техники. Physiol Behav. 1996. 60: 1565–1568. pmid: 8946506
  10. 10. Рассел WMS, Берч Р.Л. Принципы гуманной экспериментальной техники. Уитхэмпстед (Великобритания): Федерация университетов защиты животных; 1959.
  11. 11. Танненбаум Дж, Беннетт Б.Т. 3П Рассела и Берча тогда и сейчас: необходимость ясности в определении и цели.J Am Assoc Lab Anim Sci. 2015; 54: 120–32. pmid: 25836957
  12. 12. Фернандес И., Пенья А., Дель Тесо Н., Перес В., Родригес-Куэста Дж. Параметры клинической биохимии у мышей C57BL / 6J после сбора крови из поднижнечелюстной вены и ретроорбитального сплетения. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2010; 49: 202–6. pmid: 20353696
  13. 13. Кристенсен С.Д., Миккельсен Л.Ф., Фелс Дж.Дж., Бодварсдоттир ТБ, Хансен А.К. Качество плазмы, отобранной разными методами при многократном заборе крови у мышей.Lab Anim. 2009; 43: 65–71. pmid: 1

    62

  14. 14. Хоггатт Дж., Хоггатт А.Ф., Тейт Т.А., Фортман Дж., Пелус Л.М. Обескровливание лабораторной мыши: не все методы одинаковы. Exp Hematol. 2016; 44: 132–137. pmid: 26644183
  15. 15. Holmberg H, Kiersgaard MK, Mikkelsen LF, Tranholm M. Влияние техники забора крови на качество крови и благополучие животных у гемофильных мышей. Lab Anim. 2011; 45: 114–120. pmid: 21382833
  16. 16. Тейлманн А.С., Найгаард Мадсен А, Холст Б., Хау Дж., Розелл Б., Абельсон KSP.Физиологическое и патологическое влияние забора крови при ретробульбарной пункции синуса и флеботомии лицевой вены у лабораторных мышей. Джонсон CJ, редактор. PLoS One. 2014; 9: e113225. pmid: 25426941
  17. 17. Цай П-П, Шлихтиг А., Циглер Э., Эрнст Х., Хаберстрог Дж., Стельцер HD и др. Влияние различных методов сбора крови на показатели благополучия мышей. Лаборатория Аним (Нью-Йорк). 2015; 44: 301–310. pmid: 26200084
  18. 18. Соренсен Д.Б., Мецдорф С.Б., Йенсен Л.К., Андерсен К.Х., Тейлманн А.С., Йенсен Х.Э. и др.Зависящие от времени патологические и воспалительные последствия различных методов забора крови у мышей. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2019; 58: 362–372. pmid: 30947767
  19. 19. Roughan JV, Wright-Williams SL, Flecknell PA. Автоматический анализ послеоперационного поведения: оценка HomeCageScan как нового метода для быстрого выявления болевого и обезболивающего воздействия у мышей. Lab Anim. 2009; 43: 17–26. pmid: 177
  20. 20. Йиркоф П. Рытье нор и строить гнезда как индикаторы благополучия мышей.J Neurosci Methods. 2014; 234: 139–146. pmid: 24525328
  21. 21. Миллер А.Л., Флекнелл П.А., Лич М.К., Роуган Дж. В. Сравнение ручного и автоматического метода поведенческого анализа для оценки послеоперационной боли у мышей. Appl Anim Behav Sci. 2011; 131: 138–144.
  22. 22. Бауманс В. Научно-обоснованная оценка благополучия животных: Лабораторные животные. МЭБ Rev Sci Tech. 2005; 24: 503–514.
  23. 23. Херст Дж. Л., Барнард Си Джей, Толладей Ю., Невидение КМ, Западный компакт-диск.Содержание и благополучие лабораторных крыс: влияние плотности посадки клеток и поведенческих предикторов благополучия. Anim Behav. 1999. 58: 563–586. pmid: 10479372
  24. 24. Тейлманн А.С., Каллиокоски О., Соренсен Д.Б., Хау Дж., Абельсон К.С.П. Сравнение ручного и автоматического отбора проб крови: влияние повторного отбора проб крови на параметры стресса и поведение самцов мышей NMRI. Lab Anim. 2014; 48: 278–291. pmid: 24958546
  25. 25. Харикришнан В.С., Хансен А.К., Абельсон К.С., Соренсен ДБ.Сравнение различных методов забора крови у мышей и крыс: влияние на благополучие животных. Lab Anim. 2017; 52: 002367721774133. pmid: 2

    33

  26. 26. Мур Е.С., Клеланд Т.А., Уильямс В.О., Петерсон С.М., Сингх Б., Саутхард Т.Л. и др. Сравнение флеботомии путем ампутации кончика хвоста, пункции лицевой вены и разреза хвостовой вены у мышей C57BL / 6 с использованием физиологических и поведенческих показателей боли и дистресса. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2017; 56: 307. no_doi / 14239590 pmid: 28535866
  27. 27.Уиттакер А.Л., Баркер TH. Влияние обычных методов отбора проб крови у мышей (Mus musculus) на самочувствие и качество образцов: систематический обзор. Животные. 2020; 10: 989. pmid: 32517144
  28. 28. Кроули Дж. Н., Белкнап Дж. К., Коллинз А., Крэбб Дж. К., Франкель В., Хендерсон Н. и др. Поведенческие фенотипы инбредных линий мышей: значение и рекомендации для молекулярных исследований. Психофармакология. 1997; 132; 107–124. pmid:

    08

  29. 29. Бэтти Дж., Джордан Э., Кокс Д., Дав У.План действий по геномике мышей. Генетика природы. Издательская группа «Природа»; 1999; 21; 73–75. pmid: 9

    4
  30. 30. Сапольский Р.М., Ромеро Л.М., Мунк А.У. Как глюкокортикоиды влияют на реакцию на стресс? Интеграция разрешающих, подавляющих, стимулирующих и подготовительных действий *. Endocr Rev.2000; 21: 55–89. pmid: 10696570
  31. 31. Пальме Р. Неинвазивное измерение глюкокортикоидов: достижения и проблемы. Физиология и поведение; 2019; 229–243. pmid: 30468744
  32. 32.Цезарович Н., Аррас М., Йиркоф П. Влияние ингаляционной анестезии, хирургического вмешательства и обезболивающего лечения на поведение лабораторных мышей в домашней клетке. Appl Anim Behav Sci. 2014; 157: 137–145.
  33. 33. Hohlbaum K, Bert B, Dietze S, Palme R, Fink H, Thöne-Reineke C. Систематическая оценка благополучия мышей для процедур с использованием общей анестезии. J Vis Exp. 2018; 133: e57046. pmid: 29630060
  34. 34. Джиркоф П., Рудек Дж., Левейоханн Л. Оценка аффективного состояния лабораторных грызунов для обеспечения благополучия животных — каков прогресс в прикладных изысканиях? Животные; 2019; 9: 1026.pmid: 31775293
  35. 35. Bracke MBM, Hopster H. Оценка важности естественного поведения для благополучия животных. J Agric Environ Ethics. 2006; 19: 77–89.
  36. 36. Bodden C, Siestrup S, Palme R, Kaiser S, Sachser N, Richter SH. Доказательная оценка степени тяжести: влияние повторного или однократного тестирования в открытом поле на благополучие мышей C57BL / 6J. Behav Brain Res. 2018; 336: 261–268. pmid: 28842269
  37. 37. Диакон Р.М. Оценка строительства гнезда у мышей.Nat Protoc. 2006; 1: 1117–1119. pmid: 17406392
  38. 38. Hess SE, Rohr S, Dufour BD, Gaskill BN, Pajor EA, Garner JP. Усовершенствование дома: мыши C57BL / 6J, которым дали более натуралистичный материал для гнездования, строят гнезда лучше. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2008. 47: 25–31.
  39. 39. Гаскилл Б.Н., Карас А.З., Гарнер Дж. П., Притчетт-Корнинг КР. Гнездо как индикатор здоровья и благополучия лабораторных мышей. J Vis Exp. 2013; 51012. pmid: 24429701
  40. 40. Лэнгфорд DJ, Бейли А.Л., Чанда М.Л., Кларк С.Е., Драммонд Т.Э., Эчолс С. и др.Кодирование мимики боли лабораторной мыши. Нат методы. 2010; 7: 447–449. pmid: 20453868
  41. 41. Buijs RM, Kalsbeek A. Гипоталамическая интеграция центральных и периферических часов. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 521–526. pmid: 11433377
  42. 42. Калсбек А., Ван дер Спек Р., Лей Дж., Эндерт Э, Буйс Р.М., Флиерс Э. Циркадные ритмы в оси гипоталамо-гипофиз-надпочечники (HPA). Mol Cell Endocrinol. 2012; 349: 20–29. pmid: 21782883
  43. 43.Touma C, Bunck M, Glasl L, Nussbaumer M, Palme R, Stein H и др. Мыши, отобранные по высокой или низкой реактивности на стресс: новая животная модель аффективных расстройств. Психонейроэндокринология. 2008; 33: 839–862. pmid: 18502051
  44. 44. Touma C, Sachser N, Möstl E, Palme R. Влияние пола и времени суток на метаболизм и выведение кортикостерона с мочой и фекалиями мышей. Gen Comp Endocrinol. 2003. 130: 267–78. pmid: 12606269
  45. 45. Touma C, Palme R, Sachser N.Анализ метаболитов кортикостерона в образцах фекалий мышей: неинвазивный метод мониторинга гормонов стресса. Horm Behav. 2004; 45: 10–22. pmid: 14733887
  46. 46. Ибаргуен-Варгас Y, Surget A, Touma C, Palme R, Belzung C. Многогранные штаммоспецифичные эффекты в мышиной модели депрессии и отмены антидепрессантов. Психонейроэндокринология. 2008. 33: 1357–1368. pmid: 187

  47. 47. Surget A, Tanti A, Леонардо ED, Laugeray A, Rainer Q, Touma C и др.Антидепрессанты привлекают новые нейроны для улучшения регуляции стрессовой реакции. Мол Психиатрия. 2011; 16: 1177–1188. pmid: 21537331
  48. 48. Friard O, Gamba M. BORIS: бесплатное универсальное программное обеспечение с открытым исходным кодом для регистрации событий для кодирования видео / аудио и наблюдений в реальном времени. Фитцджон Р., редактор. Методы Ecol Evol. 2016; 7: 1325–1330.
  49. 49. Jirkof P, Fleischmann T, Cesarovic N, Rettich A, Vogel J, Arras M. Оценка послеоперационного дистресса и боли у лабораторных мышей по шкале сложности гнезда.Lab Anim. 2013; 47: 153–161. pmid: 23563122
  50. 50. Гийу Дж. П., Сени М., Эдгар Н., Сибилль Э. Интегрированная поведенческая z-оценка повышает чувствительность и надежность поведенческого фенотипирования у мышей: отношение к эмоциональности и сексу. J Neurosci Methods. 2011; 197: 21–31. pmid: 21277897
  51. 51. Герман Дж. П., МакКлвин Дж. М., Гхосал С., Копп Б., Вулсин А., Макинсон Р. и др. Регуляция гипоталамо-гипофизарно-надпочечникового стрессового ответа. Compr Physiol.2016; 6. pmid: 27065163
  52. 52. Madetoja J, Madetoja M, Mäkinen J, Riuttala E, Jokinen J. Взятие пробы крови из хвостовой вены по сравнению с двумя другими методами вызывает меньший стресс у мышей. Scand J Lab Anim Sci. 2009; 36: 215–221.
  53. 53. Ким С., Фунг Д., Купер М.С., Сейбел М.Дж., Чжоу Х. Сравнение методов забора крови для измерения уровня кортикостерона в плазме у мышей, связанных с минимальными артефактами, связанными со стрессом. Стероиды. 2018; 135: 69–72. pmid: 29548771
  54. 54.Gjendal K, Kiersgaard MK, Abelson K, Sørensen DB, Ottesen JL. Сравнение подъязычной, лицевой и ретробульбарной пробы крови у мышей в отношении благополучия животных и качества крови. J Pharmacol Toxicol Methods. 2020; 103: 106680. pmid: 32057916
  55. 55. Фойгт С., Клёкнер П., Тома С., Нойшль С., Брокманн Г., Гериц Ф. и др. Гормональный стрессовый ответ лабораторных мышей на обычные и минимально инвазивные методы кровотечения. Anim Welf. 2013; 22: 449–455.
  56. 56.Mittal A, Gupta M, Lamarre Y, Jahagirdar B, Gupta K. Количественная оценка боли у серповидных мышей с использованием мимики и измерений тела. Клетки крови, Mol Dis. 2016; 57: 58–66. pmid: 26852657
  57. 57. Буркхолдер Т., Фольц С., Карлссон Э., Линтон К.Г., Смит Дж. М.. Оценка здоровья экспериментальных лабораторных мышей. Curr Protoc Mouse Biol. 2012; 2: 145–165. pmid: 22822473
  58. 58. Севчик М.А., Йонас Б.М., Линдси Т.Х., Халворсон К.Г., Гиларди Дж.Р., Кусковски М.А. и др.Эндогенные опиоиды подавляют боль поджелудочной железы на ранней стадии на мышиной модели рака поджелудочной железы. Гастроэнтерология. 2006; 131: 900–910. pmid: 16952558
  59. 59. Rock ML, Karas AZ, Rodriguez KBG, Gallo MS, Pritchett-Corning K, Karas RH и др. Тест на время интеграции в гнездо как индикатор благополучия лабораторных мышей. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2014; 53: 24–8. pmid: 24411776
  60. 60. Hohlbaum K, Bert B, Dietze S, Palme R, Fink H, Thöne-Reineke C. Классификация степени тяжести повторной анестезии изофлураном у мышей C57BL / 6JRj — Оценка степени дистресса.PLoS One. 2017; 12: e0179588. pmid: 28617851
  61. 61. Миллер А., Китсон Г., Скалкояннис Б., Лич М. Влияние изофлурановой анестезии и бупренорфина на шкалу гримасы мышей и поведение мышей CBA и DBA / 2. Appl Anim Behav Sci. 2015; 172: 58–62. pmid: 26

    1

  62. 62. Hohlbaum K, Bert B, Dietze S, Palme R, Fink H, Thöne-Reineke C. Влияние повторной анестезии кетамином и ксилазином на самочувствие мышей C57BL / 6JRj. PLoS One. 2018; 13: e203559.pmid: 30231081
  63. 63. van’t Land CJ, Hendriksen CFM. Изменение модели двигательной активности у мышей: модель распознавания дистресса? Lab Anim. 1995; 29: 286–293. pmid: 7564213
  64. 64. Häger C, Keubler LM, Talbot SR, Biernot S, Weegh N, Buchheister S и др. Бег в колесе: определение индивидуальных уровней серьезности у мышей. PLOS Biol. 2018; 16: e2006159. pmid: 30335759
  65. 65. Шмидт К., Шунке О., Форкманн К., Бингель У. Повышенная краткосрочная сенсибилизация лица по сравнению с тепловой болью в конечностях.J Pain. 2015; 16: 781–790. pmid: 26043953
  66. 66. Родригес Э., Сакурай К., Сюй Дж., Чен Й., Тода К., Чжао С. и др. Черепно-лицевой моносинаптический контур способствует усилению аффективной боли. Nat Neurosci. 2017; 20: 1734–1743. pmid: 209
Руководство по сбору крови

| Поддержка исследований

BU IACUC Институциональный комитет по уходу и использованию животных IACUC контролирует … Утверждено в сентябре 2008 г .; Пересмотрено в январе 2014 г., пересмотрено в январе 2019 г., утверждено в феврале 2019 г.

Весь нетерминальный забор крови без замещающих жидкостей ограничен 10% от общего объема циркулирующей крови здорового животного в течение двухнедельного периода.В среднем общий объем циркулирующей крови составляет 5,5-7,0% (~ 66 мл / кг) от веса тела животного. Если требуются большие количества, то можно забрать до 15% от общего объема циркулирующей крови, если во время забора крови вводят замещающие жидкости. Пример: рассчитано, что кролик массой 4 кг имеет общий объем крови 264 мл (66 мл / кг x 4,0 кг). Таким образом, 26 мл (10% от 264 мл) можно собрать без добавления жидкости для замены, а 40 мл (15% от 264 мл) можно собрать, если жидкость для замены вводится один раз в две недели.Удаление 15% от общего объема крови должно быть обосновано протоколом IACUC и одобрено IACUC.

Ограничения на сбор крови сохраняют состояние здоровья животного и поддерживают достоверность экспериментальных результатов, основанных на образцах крови. Приведенные инструкции предназначены для здоровых, нормальных взрослых животных. Молодые, пожилые, находящиеся в стрессовом состоянии животные, подвергшиеся экспериментальным манипуляциям или страдающие сердечными или респираторными заболеваниями, могут быть неспособны переносить такое количество кровопотери.

Процедуры

РазвернутьСвернуть все Рекомендации
Таблица 1: Приблизительные объемы образцов крови для различных масс тела
Масса тела (г) * CBV (мл)

Объем циркулирующей крови

1% CBV (мл)

каждые 24 часа †

7.5% CBV (мл)

каждые 7 дней †

10% CBV (мл)

каждые 2 недели †

20 1,10 — 1,40 .011 — .014 .082 — .105 .11 — .14
25 1,37 — 1,75 .014 -.018 .10 — .13 .14 — .18
30 1,65 — 2,10 .017 — .021 .12 — .16 .17 — .21
35 1,93 — 2,45 0,019 — 0,025 .14 — 0,18 ,19 — 0,25
40 2,20 — 2,80 0,022 — 0,028 ,16 — 0,21 ,22 — 0,28
125 6,88 — 8,75 0,069 — 0,088 0,52 — 0,66 .69 — 0,88
150 8,25 — 10,50 0,082 — .105 0,62 — 0,79 .82 — 1,0
200 11,00 — 14,00 .11 -. 14 0,82 — 1,05 1,1 — 1,4
250 13.75 — 17,50 0,14 — 0,18 1,0 — 1,3 1,4 — 1,8
300 16,50 — 21,00 0,17 — 0,21 1,2 — 1,6 1,7 — 2,1
350 19,25 — 24,50 .19 — 0,25 1,4 — 1,8 1,9 — 2,5

* Объем циркулирующей крови

† максимальный объем пробы для этой частоты отбора проб

Если у животного регулярно обескровливают кровь, красный Упакованный объем клеток крови (PCV) следует проверять еженедельно, чтобы определить, когда следует приостановить сбор крови, чтобы животное могло вылечиться от потенциальной анемии. Хотя у здоровых взрослых животных объем крови может восстановиться в течение 24 часов, для всех остальных компонентов крови может потребоваться до 2 недель (т.е. клетки, белки) для замены.

Контролируя гематокрит (Hct или объем упакованных клеток — PCV) и / или гемоглобин животного, можно оценить, достаточно ли оно восстановилось после одного или нескольких заборов крови. После внезапной или острой кровопотери гематокрит и гемоглобин отразят эту потерю в течение 24 часов. Как правило, если гематокрит животного составляет менее 35% или концентрация гемоглобина менее 10 г / дл, удалять кровь небезопасно.

Нормальный объем упакованных клеток (PCV) для некоторых лабораторных животных (%)
Мышь 39-49 Собака 29-55
Крыса 36-54 Кошка 25-41
Песчанка 43-60 Резус 26-48
Хомяк 40-61 Бабуин 33-43
Кролик 30-50 Свинья 32-50
Морская свинка 37-48 Корова 24 -48
Овцы 24-45

Места сбора крови у мышей и крыс

Следующие рекомендации относятся к наиболее часто используемым местам отбора проб выживания: а) ретроорбитальные; б) нижнечелюстная вена; в) подкожная вена; г) хвостовые жилки; д) яремная вена.Забор крови сердечной пункцией считается процедурой эвтаназии и должен выполняться только после того, как животное находится под глубокой анестезией, о чем свидетельствует отсутствие реакции на болезненный раздражитель (например, защемление пальца или хвоста). Список вопросов, которыми следует руководствоваться при выборе маршрута (ов) сбора крови для выживания, приведен ниже, а ссылка на сводную таблицу (Таблица 2) находится внизу этой страницы.

Методы забора крови

РазвернутьСвернуть все

Забор крови из верхней лицевой вены — безопасный и быстрый метод у мышей.Это требует кратковременного ограничения, и примерно 200 мкл крови можно легко получить от здоровой взрослой мыши. Сосуд расположен прямо под кожей, непосредственно каудальнее лицевых вибрисс (усов) в углу челюсти. Возможен повторный отбор проб путем чередования сторон лица. Необходимые материалы включают в себя иглу или ланцет для подкожных инъекций 20 или 22 г, изготовленные для этой цели, пробирки для забора крови и стерильную марлю. Перед выполнением этой процедуры необходимо пройти обучение.

  • Может использоваться как у крыс, так и у мышей путем канюлирования кровеносного сосуда или поверхностного надрезания сосуда перпендикулярно хвосту.
  • Сбор образцов путем надрезания сосуда легко выполняется у обоих видов, но дает образец различного качества, который может быть загрязнен тканями и кожными продуктами.
  • Возможны повторные коллекции. При прокалывании хвостовой вены сгусток / струп можно аккуратно удалить для повторных небольших проб, если требуется серийное тестирование (например,g., измерение уровня глюкозы и т. д.)
  • Взятие пробы из хвостовой артерии дает больший объем, но требует анестезии и помещения животного в положение лежа на спине. Также необходим хороший гемостаз, как всегда при надрезании артерии.

Может использоваться как у крыс, так и у мышей и других грызунов путем прокалывания подкожной вены иглой или комбинированной иглой / трубкой для забора крови.

  • Доступные объемы крови: от среднего до большого.
  • Результат в высококачественном образце.
  • Взятие пробы из яремной вены можно проводить без анестезии, хотя использование анестезии значительно облегчает процедуру.
  • Трудно поддается повторному последовательному отбору проб.

  • Забор ретроорбитального образца можно использовать у мышей, крыс и хомяков (хотя обычно это не метод выбора у крыс) путем проникновения в ретроорбитальный синус у мышей или сплетение у крыс и хомяков с помощью стеклянной капиллярной трубки или пипетки Пастера.
  • Повторный отбор проб с той же орбиты может быть затруднительным (рекомендуется от 10 дней до 2 недель между последовательными кровотечениями). Однако не следует пытаться чередовать орбиты, пока флеботомист не овладеет техникой на той же орбите.

Животных необходимо физически удерживать, чтобы предотвратить любое движение, которое может привести к разрыву кровеносного сосуда или другим потенциально серьезным осложнениям. Кровь может быть взята у бодрствующих животных, которых удерживают надлежащим образом, при условии, что лица, выполняющие процедуру, обладают соответствующей квалификацией.

Анестезия требуется, если забор крови проводится через ретроорбитальный синус или пункцию сердца из-за стресса и боли, которые могут быть вызваны, а также из-за серьезных осложнений (травма глаза, тампонада сердца и смерть ) связанные с этими маршрутами. Для процедур выживания, требующих анестезии, рекомендуется изофлуран, так как он короткодействующий и позволяет заменить грызуна в клетке за считанные минуты.

Виды Места сбора и разрешенные условия
Кролик Сердечная (только под наркозом в качестве последней процедуры), яремная вена , краевая ушная вена (только для небольшого объема), ушная артерия (требует хорошего гемостаза)
Собака и кошка Головные, подкожные вены, бедренные и яремные вены
Жвачные животные Яремная вена
Свинья Яремная вена, передняя полая вена, вены уха
Нечеловеческие приматы Бедренная, головная вена, подкожная вена

Fl Замена жидкости

Раствор Рингера с лактатом (LRS) рекомендуется как лучший для восполнения жидкости.Мышам вводят 1 мл подогретой ЛРС внутрибрюшинно или п / к. Крысам вводят 5-10 мл нагретого LRS 1/2 через IP и 1/2 через SC.

Пищевая добавка

Когда изымаются большие объемы, особенно при повторном отборе проб, грызунам рекомендуется принимать питательный или диетический гель в качестве пищевой добавки. Для крыс и мышей это легко сделать, намазав Nutrical несколько гранул или поставив открытую емкость с кормом на пол клетки. Более крупным видам, не относящимся к грызунам, также могут быть предложены легкоусвояемые и привлекательные пищевые добавки.

Обучение

Обучение требуется для сбора крови у всех видов и любым способом. Пожалуйста, свяжитесь с BU ASC. Центр зоотехники контролирует и контролирует связь с животными … чтобы составить график обучения.

  1. NIH Национальные институты здравоохранения Рекомендации по выживанию кровотечений у мышей и крыс, 2012 г.
  2. Политика IACUC Бостонского университета по сбору крови

Таблица 2: Краткое изложение методик взятия проб крови грызунов

BU IACUC Утверждено в сентябре 2008 г. ; Пересмотрено в январе 2014 г., пересмотрено в январе 2019 г., утверждено в феврале 2019 г.

4 основных метода сбора крови у лабораторных грызунов

Методы сбора крови у мышей могут иметь различное воздействие на животных.Каждый метод требует анестезии или ограничения, в зависимости от области, из которой берется кровь. В некоторых областях во время сбора крови образуется больше крови, и в инструкциях указано общее количество, которое может быть взято из мыши с помощью каждого метода.

1. Забор венозной крови из боковой вены хвоста или подчелюстной вены обычно берут, когда мышь удерживают, но не анестезируют. Оба эти метода требуют специального оборудования, а забор боковой вены из хвоста дает лишь небольшое количество крови.Поднижнечелюстная вена предпочтительна, потому что она идеально подходит для серийного отбора проб и может брать умеренное количество крови.

2. Подкожная или ретроорбитальная вена сбор — другой способ . Оба эти места сбора требуют дополнительной подготовки и навыков. Удаление из подкожной вены требует большого мастерства, чтобы постоянно брать измеримое количество крови.

Из-за обширной подготовки места мышь может получить больше травм из-за длительного удерживания.По ретроорбитальной вене может поступать средний или большой объем крови, но за мышью необходимо наблюдать в течение двух дней после взятия крови, поскольку могут возникнуть визуальные осложнения.

3. Так называемый «терминальный» или «невыживший» сбор крови проводится либо до, либо после смерти, и только после того, как мышь подверглась хирургической анестезии. Терминальный забор может быть произведен с помощью сердечной пункции и позволяет собрать максимальное количество крови. Это также можно сделать через аорту или полую вену.Сразу после взятия крови любым из этих двух методов — и до того, как мышь оправится от анестезии — мышь должна быть умерщвлена.

4. Микровыборка оказывает наименьшее воздействие на животное; при местной анестезии берется очень небольшое количество крови. Технология объемного абсорбционного микровыбора (VAMS ® ) обеспечивает последовательный и точный сбор объема крови (примерно 10 микролитров). Технология VAMS предоставляет качественные и количественные данные, упрощая при этом процесс сбора крови, а также лабораторные процедуры, необходимые для тестирования.

Гидрофильные наконечники пробоотборных устройств VAMS заполняются через 2-5 секунд контакта с небольшим количеством крови. Это упрощает метод отбора проб и стандартизирует объем пробы.

Микровыборки не являются предпочтительным методом экстракции при взятии проб у грызунов с опухолями или когда требуются технические реплики. Кроме того, трудно контролировать скорость кровотечения во время отбора проб, что может привести к отбору большего количества крови, чем может быть использовано при тестировании.

Общие принципы | NC3Rs

Забор крови может вызывать стресс у лабораторных животных из-за того, что они обращаются с ними, сдерживают себя, анестезируют или вызывают дискомфорт, связанные с определенной техникой.Сведение стресса к минимуму отвечает интересам хорошей науки, а также благополучия животных. Соблюдение следующих общих принципов поможет в этом.

Лицензионный орган, обучение и квалификация

Орган проектного и персонального лицензирования
  • В Великобритании забор крови считается научной процедурой, когда образец отбирается в научных целях. Хотя удаление крови само по себе может иметь неблагоприятные последствия для животного, боль, вызванная методом отбора проб (т.е. введение иглы в кожу) считается превышающим уровень, выше которого работа должна регулироваться ASPA.
  • В лицензии на проект должны быть указаны место, объем и частота взятия проб крови. Это должно быть обосновано с точки зрения науки и защиты животных.
  • Лицо, берущее образец крови, также требует личного разрешения. Технику взятия крови можно только наблюдать и не практиковать до подачи заявки на получение личной лицензии. После получения личной лицензии сбор крови может проводиться только под наблюдением до тех пор, пока новый лицензиат не будет признан компетентным в конкретной методике (ах).

Обучение и повышение квалификации
  • Компетентность в обращении с животными и их сдерживании — важная предпосылка для взятия проб крови. Пожалуйста, ознакомьтесь с нашим специальным ресурсом по обращению и сдержанности.
  • Обучение должно проводиться соответствующими компетентными инструкторами, чтобы передавались наиболее совершенные и современные методы.
  • Критерии компетентности должны быть определены для каждой техники. Например, компетентность в заборе крови из головной вены собаки будет включать демонстрацию:
    • Знание техники (эл.грамм. пригодность для данной цели, соответствующий размер иглы, допустимые объемы сбора, потенциальные побочные эффекты и способы борьбы с ними, как обращаться с взятым образцом крови)
    • Умение спокойно сдерживать собаку
    • Способность соответствующим образом подготовить место отбора пробы, включая удаление шерсти и подготовку кожи таким образом, чтобы не причинять страдания собаке и не повредить кожу
    • Точное расположение и хорошее расширение сосуда
    • Введение иглы без причинения вреда собаке
    • Отбор негемолизированной крови с соответствующей скоростью и объемом без образования синяков
  • Перед тем, как пытаться выполнять какие-либо техники, тренеры должны обсудить со слушателями ожидания относительно компетентности в конкретной технике и того, как будут оцениваться навыки.Факторы, которые будут определять компетентность, включают оценку соблюдения протокола, отношение и сочувствие и внимание к здоровью и безопасности, а также компетентность в практических навыках, необходимых для взятия проб крови.
  • Объем обучения и практики, необходимых для достижения заданного уровня компетенции в конкретной технике, варьируется от человека к человеку в зависимости, например, от ловкости рук, предыдущего опыта, отношения и навыков инструктора. Переподготовка или дополнительный контроль необходимы, если методика не используется в плановом порядке, и следует поощрять людей обращаться за помощью в случае необходимости.
  • Неопытные люди должны сначала осмотреть мертвых животных (усыпленных для другой цели), чтобы изучить соответствующую анатомию и, таким образом, избежать повторных неудачных вводов при попытке найти кровеносный сосуд. Следует использовать демонстрационные и обучающие видеоролики, такие как те, что представлены на этом ресурсе и на веб-сайте Norecopa. Неодушевленные предметы (например, апельсины) и имитационные обучающие средства / ветеринарные тренажеры (например, CurVet TM Rat Training Simulator, Mimicky Mouse, модели головы и передних конечностей собаки) можно использовать для ознакомления с обращением и использованием игл и шприцев, прежде чем выполнять какие-либо действия. работа с живыми животными.Наблюдение за опытным персоналом также поможет в освоении техники.
  • DOPS (Прямое наблюдение за процедурными / практическими навыками) — это четко определенный механизм для измерения компетентности человека в процедуре или практической задаче. На веб-сайте LASA DOPS есть ДОФ для взятия проб крови у различных видов млекопитающих.

Пылесосы
  • Чтобы предотвратить чрезмерное вакуумирование шприца, рассмотрите возможность использования пробирок для забора крови Vacutainer, которые создают вакуумное уплотнение внутри пробирки для облегчения забора заранее определенного объема крови.Это снижает вероятность образования гематом, особенно у крупных животных, таких как собаки и приматы.
  • Преимущество использования вакутейнера заключается в том, что кровь не нужно переносить из шприца в пробирку для забора крови. Кроме того, вакутейнеры могут содержать добавки для стабилизации и сохранения образца крови.

Ящики для подогрева
  • Для взятия проб крови грызунов может потребоваться согревание животных для расширения кровеносных сосудов перед взятием проб.
  • Лучшая практика — термостатировать температуру не более чем на уровне тела. Следует использовать таймер, чтобы гарантировать, что животное согревается не более 10 минут, в течение которых оно должно находиться под постоянным наблюдением, чтобы предотвратить гипертермию (на что указывает учащенное дыхание, одышка или слюноотделение).
  • Согревающие боксы не должны использовать источники излучения, такие как тепловая лампа, а температуры выше тепла тела в течение более короткого периода не рекомендуются из-за риска гипертермии.Ящик для подогрева следует регулярно калибровать.
  • Методы согрева противопоказаны беременным животным или в обстоятельствах, когда есть значительные неблагоприятные эффекты (например, когда животные достигли или приближаются к гуманной конечной точке исследования).
  • В некоторых лабораториях прикладывают локальное тепло к хвосту (например, с помощью грелки или теплой водяной бани), чтобы избежать необходимости нагревать все животное (что может вызвать больший стресс).

Удерживающие трубки
  • Если используется удерживающая трубка для грызунов, она должна соответствовать размеру животного, чтобы избежать повреждения хвоста, яичек и конечностей.Важно, чтобы он не был слишком большим или слишком маленьким, так как это может привести к травме.
  • Все формы удерживающего оборудования следует часто мыть, чтобы предотвратить стресс, вызванный феромонами, или перекрестную инфекцию.
  • Волосы вокруг места взятия пробы необходимо подстричь, а кожу обработать в асептических условиях с помощью раствора хлоргексидина на водной основе (или аналогичного). Бритье лезвием скальпеля не рекомендуется, так как это удаляет эпидермальные слои кожи.
  • Нетоксичный крем для удаления волос (Nair ® , Veet ® и т. Д.) можно рассмотреть для областей, где машинки для стрижки трудны в использовании и в этих обстоятельствах. Применение таких агентов должно производиться в соответствии с директивами производителя путем нанесения слоя на область, подлежащую депиляции, в течение указанного периода времени. Следует следить за тем, чтобы животное не слизывало сливки. Депилятор и волосы удаляются, протирая область смоченной водой марлевой салфеткой или тканью. Важно удалить все следы крема для депиляции, чтобы избежать возможного раздражения от чрезмерного воздействия активного химического агента.
  • Иглы всегда должны быть одноразовыми, чтобы избежать их загрязнения (см. Наш специальный центр по повторному использованию игл). Затупленные и использованные иглы следует утилизировать непосредственно в контейнеры для острых предметов.

Обращение и удержание
  • См. Наш специальный ресурс по обращению и сдержанности.
  • Твердое, чуткое обращение очень важно, как и время, необходимое для взятия образца крови. Оба эти параметра могут повлиять на степень стресса животного и, следовательно, на качество образца и данных исследования.
  • Животное должен удерживать опытный человек (желательно знакомый животному, особенно для более крупных видов лабораторных животных). Правильный уровень ограничения — это такой уровень, который позволяет взять удовлетворительный образец с первой попытки, но который не вызывает у животного излишнего беспокойства.
  • Можно использовать неодушевленные ограничители, хотя они не всегда могут быть лучшим методом для отдельных животных. Ручное удерживание облегчает более эффективное распознавание стресса и позволяет модифицировать удерживающее устройство в соответствии с требованиями животного.Кроме того, ограничение может не потребоваться, если используются усовершенствованные методы, такие как, например, тренировка с положительным подкреплением или микросэмплинг.
  • Вена разрушится, если образец будет взят слишком быстро, поэтому следует позаботиться о том, чтобы кровь забиралась с соответствующей скоростью.
  • В зависимости от вида, следует подумать о том, чтобы предлагать награду после каждого кровотечения.

С мышью, которая была акклиматизирована для работы с техником и обучена брать образцы крови из хвостовой вены, можно обращаться без каких-либо ограничений, без явного стресса или дискомфорта.

Размер иглы
  • Для прокола кожи и нижележащих кровеносных сосудов следует использовать стерильную иглу (или ланцет).
  • Размер иглы (длина и диаметр отверстия) очень важен.
  • Рекомендуется использовать иглу достаточного диаметра для обеспечения быстрого забора крови без разрушения вены в рамках ограничения по предотвращению гематомы (т.е. отверстие должно быть чуть меньше диаметра сосуда).
  • Поскольку поверхностные кровеносные сосуды расположены близко к поверхности кожи, иглы, используемые для отбора проб из этих вен, должны быть минимальной длины.Это обеспечит наилучший контроль иглы во время введения, уменьшая риск травмы животного.
  • Рекомендации по правильному размеру иглы даны для конкретных техник, представленных на этих страницах. Рекомендуется максимальная толщина 25G для грызунов и 21G для собак.

Место и расположение жилы
  • Выберите место, которое соответствует назначению и вызывает минимальный стресс у животного. Например, если забор крови проводится после процедуры внутривенного дозирования, подумайте, можно ли взять образец из другой вены.
  • Обратите внимание, что образцы, взятые из разных мест, могут иметь различия в биохимических / гематологических значениях, поэтому следует использовать один и тот же сосуд, если образцы собираются на протяжении всего исследования (например, всегда из хвостовой вены). Если необходим повторный отбор проб, важно выбрать сосуд, который позволит вам переключаться между участками отбора проб, чтобы избежать синяков и т. Д.
  • Время следует потратить на точное определение местоположения и, при необходимости, на расширение вены вручную с помощью давления перед проколом сосуда.
  • Рекомендуется сделать не более трех попыток взять образец крови путем венепункции. Если попытки собрать кровь не увенчались успехом, животное следует оставить для выздоровления и повторить попытку взятия пробы позднее и желательно другим человеком.

Расширение вены
  • У находящихся в сознании грызунов кровь легче получить, если у животного (или части животного, у которого взят образец), например.грамм. хвост) сначала нагревают в соответствии с передовой практикой.
  • У животных, находящихся под наркозом, в результате действия анестетика может произойти расширение сосудов. Следовательно, животные, находящиеся под наркозом, могут не нуждаться в обогреве, поэтому следует рассмотреть возможность кровотечения, когда животных вводят наркоз для другой цели.
  • Анестезия обычно не требуется для венозного доступа, поскольку связанный с этим стресс, вероятно, будет больше, чем дискомфорт от укола иглой или прокола копьем.
  • Использование местного анестетика (например.грамм. EMLA, LMX) обеспечивает эффективное обезболивание для предотвращения дискомфорта и боли при венепункции. Однако для полного действия этих соединений требуется время контакта 15-30 минут. Чтобы животные не слизывали крем после его нанесения, эту область можно закрыть окклюзионной повязкой (хотя у мелких грызунов это может вызвать практические трудности).
  • Следует проконсультироваться с ветеринаром о наиболее подходящем анестетике. Некоторые анестетики или компоненты анестезирующих смесей (например,грамм. медетомидин или ксилазин) вызывают сужение сосудов, поэтому его следует избегать.

Возможные побочные эффекты

Потенциальные проблемы, которые могут возникнуть в результате неправильной техники отбора проб, включают стресс, кровотечение, синяк, тромбоз, инфекцию в месте введения иглы, флебит, рубцы и повреждение нервов. Консультации по лечению побочных эффектов следует запрашивать у ветеринарного хирурга.

  • Кровоизлияние из-за плохого гемостаза не является распространенной проблемой, если у животного нет дефекта свертывания крови, и в некоторых случаях для остановки кровотечения достаточно легкого непрерывного давления в течение нескольких минут.Для остановки кровотечения после взятия пробы артерии может потребоваться более длительное сжатие места прокола.
  • «Синяк» возникает из-за подкожного кровотечения во время венепункции или после того, как животное было помещено в клетку или загон, когда это место может быть ухудшено самим животным из-за облизывания или трения. Примерно через 30 минут животное следует осмотреть и, при необходимости, принять соответствующие меры (например, проконсультироваться с ветеринарным хирургом).
  • Тромбоз (свертывание крови) и флебит (воспаление вены) обычно вызваны несоблюдением асептических методов.Иногда они могут привести к членовредительству.

Пункция артерии

Основная причина забора крови из артерий заключается в том, что большие образцы можно получить быстро и относительно легко. Многие из принципов, описанных выше для венепункции, применимы и к артериальной пункции.

Канюля

Канюляция (также известная как катетеризация) — важный метод удаления крови, поскольку он снижает стресс от многократного отбора проб, связанный, например, с повторным удерживанием и уколами иглой.

  • Канюляцию следует рассматривать, когда требуются повторные пробы, особенно в течение относительно коротких периодов времени.
  • У некоторых видов животных может быть необходимо каким-то образом удерживать животное, чтобы оно не извлекало канюлю. Например, крыс часто удерживают ремни безопасности, шарнирные соединения и страховочные привязи, которые ограничивают нормальное движение. Перед канюляцией животных следует акклиматизировать к любой удерживающей системе.
  • Привязанных животных часто содержат поодиночке, что усугубляет стресс и усложняет процедуру.Имея дело с социальными животными, следует делать все возможное, чтобы держать их в социальных группах. Канюлированные свиньи, кошки и мартышки могут успешно содержаться в группах с соответствующей перевязкой и защитой канюли.
  • Канюля может вызвать дискомфорт у животного и, следовательно, требует послеоперационного введения анальгетиков и тщательного послеоперационного ухода и наблюдения в течение всего времени нахождения канюли на месте.
  • Инфекций, связанных с канюлями, можно избежать, используя стерильное оборудование и растворы, а также применяя асептические методы.
  • При выборе животных для канюляции их следует оценивать по состоянию здоровья, а также по поведенческому темпераменту. Это поможет гарантировать, что животное сможет справиться с дополнительными процедурами обслуживания катетера и дозирования.

См. Наш специальный ресурс по сосудистым катетерам.

Пункция сердца

  • Пункция сердца должна выполняться только под глубокой терминальной анестезией или у умерщвленных животных.
  • Этим методом принято обескровливать животных под терминальной анестезией.Если процедура предназначена для терминальной стадии, смерть после обескровливания должна быть гарантирована с помощью соответствующего метода умерщвления, как подробно описано в Приложении 1 ООРА.

Объем удаляемой крови

Объем взятой крови и частота отбора проб должны зависеть от цели научной процедуры и общего объема крови животного. Важно учитывать совокупное влияние объема пробы и частоты отбора проб. Если слишком много крови забирается слишком быстро или слишком часто без замены, у животного может возникнуть кратковременный гиповолемический шок и / или в более долгосрочной перспективе может развиться анемия (см. Ниже).Интерпретация данных и научная достоверность могут быть поставлены в тупик, если используется чрезмерная выборка.

  • Как правило, объемы и количество проб должны быть минимальными.
  • Как правило, до 10% общего объема крови (TBV) может быть взято за один раз у нормального, здорового животного при адекватном питании с минимальными побочными эффектами; этот том можно повторить через три-четыре недели. Если кровь отбирается повторно (например,грамм. еженедельно), предлагаемый предел обычно составляет 15% TBV за 28 дней. Для повторных кровотечений с более короткими интервалами (например, в течение нескольких дней) рекомендуется максимум 1,0% TBV каждые 24 часа. Следует принимать во внимание влияние стресса, выбор места и используемого анестетика.
  • Если необходимы частые пробы, следует рассмотреть возможность использования канюляции как менее стрессовой альтернативы повторной венепункции.

Как правило, общий объем крови можно оценить как 55 — 70 мл / кг массы тела.Однако следует соблюдать осторожность при этих расчетах, поскольку процент от общего количества крови будет ниже (-15%) у тучных и пожилых животных.

Ниже представлена ​​полная таблица общих объемов крови и безопасных объемов крови для лабораторных животных, домашних животных и приматов, кроме человека (адаптировано из Wolfensohn & Lloyd 2003, Справочник по содержанию и благополучию лабораторных животных, 3-е издание):

Виды

Контрольный вес (г)

Объем крови (мл / кг) $

Общий объем крови (TBV), нормальный взрослый (мл)

Безопасный объем для однократного слива (мл) *

Выпускаемый объем (мл)

Мышь

18–40

58.5

Мужской 1,5 — 2,4

Женский 1.0 — 2.4

0,1 — 0,2

Мужской 0,8 — 1,4

Женский 0,6 — 1,4

Крыса

250–500

54–70

Мужской 29-33

Женский 16-19

Мужской 2.9 — 3,3

Женский 1,6 — 1,9

Мужской 13-15

Женский 7,5 — 9

Хомяк

85-150

78

Мужской 6,3 — 9,7

Женский 7,1 — 11,2

Мужской 0,6 — 0,9

Женский 0,7 — 1,1

Мужской 2.9–4,5

Женский 3,3 — 5,2

Песчанка

55–100

66–78

Мужской 4,5 — 7

Женский 3.8 — 6

Мужской 0,4 — 0,7

Женский 0,4 — 0,6

Мужской 2,2 — 3,5

Женский 1,9 — 2,9

Морская свинка

700–1200

69–75

Мужской 59-84

Женский 48 — 63

Мужской 6-8

Женский 5-6

Мужской 29-42

Женский 24 — 31

Кролик

1000–6000

57–65

58.5 — 585

5–50

31 — 310

Хорек

600–2000

70

42–140

4–14

21–70

Собака

70 — 110 #

900–1170a

90–110

Кот

47–65

140–200

14–20

Свинья — большая белая

56–69

13 200–15 000

1320–1500

Свинья — Юкатан

56-69

4200–4800

420–480

Овцы

58–64

4060–4480

400–450

Коза

57–90

3990–6300

400–630

Крупный рогатый скот

60

27 000 — 36 000b

2700–3600

Лошадь

75

33 750 — 45 000b

3375–4500

Мартышка

60–70

21 — 24.5

2,1 — 2,4

Макака-резус

55–80

Мужской 420-770

Женский 280 — 630

Мужской 42 — 77

Женский 28 — 63

Длиннохвостая макака

50–96

Мужской 280-560

Женский 140-420

Мужской 28 — 56

Женский 14-42

$ Оценка объема крови для одного вида может не отражать различий между отдельными породами или вариаций из-за возраста, размера или болезни
* Однократное кровотечение 10% общего объема крови
# Большая вариация породы
a Бигль
b предполагает вес взрослого 450-600 кг

Руководство по эффективной практике EFPIA / ECVAM по введению веществ и удалению крови (Diehl et al.2001) также содержит рекомендуемые средние общие объемы крови и максимальные объемы проб крови для видов с заданной массой тела.

Следующие деревья решений могут помочь вам определить количество крови, которое можно взять у мышей и крыс, и, в зависимости от этого объема, выбрать наиболее подходящий метод для использования.

Признаки шока и анемии

Очень важно уметь распознавать клинические признаки шока и анемии и уметь принимать соответствующие меры.

  • Признаки гиповолемического шока включают учащенный и нитевидный пульс, бледные сухие слизистые оболочки, холодную кожу и конечности, беспокойство, гипервентиляцию и субнормальную температуру тела. При возникновении шока следует немедленно проконсультироваться с именованным ветеринарным хирургом. Если было удалено более 10% общего объема крови, обычная замена такого же объема теплого (30-39 o ° C) нормального забуференного физиологического раствора представляет собой хороший уход за животными.
  • Признаки анемии включают бледность слизистых оболочек конъюнктивы или внутри рта, бледность языка, десен, ушей или подушечек лап (непигментированные животные), непереносимость физических упражнений и, в более крайних случаях, учащенное дыхание в состоянии покоя.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *