Мангал – дикий кабан или пуховая свинья?

Содержание статьи

Мангал – гибридное животное, полученное при скрещивании венгерской пуховой мангалицы с западноевропейским диким кабаном.

Мангалитская порода свиней, которых еще называют карпатской мангалицей и «овечьей свиньей», отличается густым и кучерявым мехом. По всему телу этих свиней имеются красивые завиточки из шерсти.

Внешний вид мангалов

Мангалы – это элитная порода травоядных свиней. Осенью их тела покрываются густой шерстью. Окрас шерсти от светло-бурого и серого до черного.

По окрасу мангалы схожи с обыкновенными дикими свиньями. Если мангалов содержат в помещении, то шерсть у них становится, как у обыкновенной свиньи.

Конструкция у них не слишком мощная, а ноги тонкие с небольшими копытами. Уши имеют средние размеры.

Содержание мангалов

Эта порода мясная. На Украине, например, у данной породы существует единственный аналог – белая степная свинья. У мангалов генетически заложено большое количество мышечной ткани, а не жира, они практически никогда не становятся жирными, хотя могут весить около 300 килограммов. А мангалицы могут покрываться жиром.

Мангалы являются всеядными животными, они могут питаться и травой, и животными кормами, и пищевыми отходами. Зимой их кормят сеном, корнеплодами, стеблями кукурузы, желудями, каштанами, отрубями, костями, пшеничной брагой и низкокачественными субпродуктами. Основная задача – приучить поросят питаться любым кормом.

Мангалов просто содержать. Они отлично себя чувствуют летом и зимой на выгуле. Летом им дают ряску, падалицу с фруктовых деревьев. Они особенно любят молодые побеги, кору и корни деревьев, например, дуба. Содержание этой породы экономично, так как в основном мангалы питаются подножным кормом.

Мангалы не нуждаются в прививках, так как у них сильная иммунная система, которую они унаследовали от диких кабанов. Они хорошо переносят максимально низкие и высокие температуры. Они не подвержены стрессам.

Разведение мангалов

Вес взрослого мангала превышает 300 килограммов. Половая зрелость у них наступает в 5-7 месяцев.

Потомство мангалы могут выводить самостоятельно без помощи человека. В одном опоросе количество поросят практически в 2 раза больше, чем у мангалицы. С этим связано постепенное исчезновение породы мангалицы.

На 4-6 день молодняк ест жидкую болтушку, ячмень, мел, костную муку, сено, свеклу и траву.

Обязательно наличие воды в поилках. В возрасте 3-х недель поросята поедают яблоки. До возраста 1-го месяца поросята полосатые, но со временем полоски уходят.

Если поросят разводят для получения мяса, то их кастрируют, тогда они за 6 месяцев максимально набирают вес. От матери их отлучают в возрасте 1-го месяца. После того, как у самки забрали поросят, ее можно снова спариваться через 5 дней.

Мангалов выращивают не только для получения мяса, но и для других нужд, например, для спортивно-охотничьих целей.

https://www.youtube.com/watch?v=59ylml5C9uo

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

⋆ ✔️ Характеристика свиней породы Мангал ⋆ 🌼Farmer

Свинья породы Ростер отличается высокой продуктивностью и интересным внешним видом: довольно привлекательно выглядят кудрявые свиньи. Порода нетребовательна в содержании и прекрасно адаптируется к любому климату. Свинья мангала была выбрана для производства мяса с минимальным содержанием жира.

содержание

1. Домашняя информация
2. Особенности выращивания
3. Где хранить
4. Особенности кормления
5. Плюсы и минусы породы
6. Требования к свиноводству
7. Заключение <

Мангальные свиньи

Домашняя информация появился в 1833 году в результате скрещивания диких представителей с карпатской жаровней.

Мангальные свиньи имеют несколько преимуществ. Поскольку, в отличие от сородичей, свинья породы мангал стремительно набирает вес, взрослый кабан может весить около 300 кг. Эти свиньи относятся к элитным травоядным видам. Крупные свинофермы или опытные заводчики работают с парнокопытными более года. Мангальные поросята чрезвычайно популярны, а стоимость их относительно высока.

Мангальные свиньи делятся на 4 подвида в зависимости от окраса шерсти. В основном свиньи породы мангал белые, этот окрас характерен для 80% представителей.Остальные 20% приходятся на особи породы мангал красный (см. Фото), смешанный и черный. К сожалению, все эти представители, кроме белых, сейчас находятся на грани исчезновения.

После рождения поросята имеют полосатую шерсть. В первый месяц жизни постепенно исчезает. Даже новорожденные поросята отличаются хорошим иммунитетом и устойчивостью к холоду, поэтому зимой спокойно могут находиться в деревянном помещении без дополнительного обогрева.

Описание внешних характеристик:

• уши среднего размера;
• вьющиеся густые волосы;
• максимальная масса — 300 кг;
• корпус прочный;
• хорошая мышечная масса с минимумом жира;
• крепкие, тонкие конечности.

Особенности выращивания

Для улучшения качества мяса самцов стерилизуют. В период полового созревания происходит мощный выброс эстрогенов и эндогенов, в результате чего в мясе появляется характерный неприятный запах. Резекцию гонад рекомендуется проводить в месячном возрасте. Эта процедура также способствует ускоренному росту, поэтому иногда стерилизуют самок.

Свинки мангала достигают половой зрелости через шесть месяцев. Свиноматка выводит потомство 120 дней.Если опорос не первый, то за одну беременность свинья может перенести более 12 детенышей. Через 5 дней поросенок может есть жидкие болтушки. В месячном возрасте уже можно вводить в рацион корнеплоды и зелень.

Чтобы свиньи нормально себя чувствовали в холодное время года, необходимо обеспечить им сбалансированный рацион. В рацион должны входить такие продукты:

• корнеплодов и сена — 70%;
• каштаны, желуди — 30%;
• жидкие витамины и минералы.

Очень важно, чтобы свиньи получали достаточное количество корма, но ни в коем случае нельзя их перекармливать. Избыток корма, как и его недостаток, вредит здоровью животных: они могут даже погибнуть от переедания. Поросята отлучают от груди по достижении 4-недельного возраста. Для повышения продуктивности спаривание проводят на 5-7 день после отъема.

Поросята породы мангал обладают хорошим иммунитетом, поэтому прививать их нельзя. Мангалы дружелюбны и к другим обитателям подворья, и к людям.

Где держать

Свиньи породы Жаровня крупные, соответственно им нужно место для содержания и много выгула. Поросята мангала содержатся на огороженной территории. Прогулки организованы в местах с густой растительностью, чтобы свиньи могли полакомиться зеленью, когда захотят.

На территории прогулки необходимо установить отдельный навес, чтобы свиньи могли укрыться от дождя и жары. Для зимнего содержания необходимо построить сарай. На пол сарая кладут подстилку из соломы или сена.Дополнительного отопления не требуется.

Свинарник лучше всего строить из дерева. Свинарник необходимо оборудовать системой вентиляции. Важным моментом в содержании свиней является поддержание оптимального микроклимата в помещении, также важно не допускать антисанитарных условий. Подстилки необходимо регулярно менять.

Сведения о кормлении

Барбекю — всеядные животные. Вопреки стереотипам, этим представителям совсем не нужно много еды. Основа тушки свиньи — мышечная масса.В хороших условиях мангалы набирают 600 г в сутки.

Если нет возможности выгуливать свиней, нужно готовить для них корм самостоятельно. Свинка нуждается в достаточном количестве зелени, поэтому вам придется для нее косить траву. Также в рационе должно быть достаточное количество овощей: тыква

• ;
• кабачок;
• свеклы;
• морковь;
• картофель.

Жаровни могут потреблять практически всю растительность, включая не только овощи, но и фрукты. Единственный запрет — абрикосы: их косточки вызывают отравление у домашних животных.Все овощные культуры и фрукты необходимо натереть на терке и только потом давать свиньям. Чтобы поросята росли быстрее, в рацион вводят крупы.

Когда питомец достигает веса 150 кг, нужно разнообразить рацион и следить за его балансом: при нехватке полезных веществ рост может полностью прекратиться. Чтобы свиньи научились добывать себе корм, их нужно приучать к этому в раннем возрасте. Идеальный вариант — когда свиньи идут гулять с матерью.

Плюсы и минусы породы

Отзывы тех, кто содержит свиней породы мангал, в основном положительные.Заводчики довольны простотой содержания и ухода за этими свиньями. Основные достоинства — хорошая приспособляемость представителей этой породы к любым климатическим условиям и экономичность в плане кормления.

Заводчики отмечают, что мясо мангалов намного нежнее, чем у других свиней, и практически не содержит жира. К минусам можно отнести высокую цену чистокровных особей. К тому же их очень сложно достать. Такая свинья может стоить более 12000 рублей.Все зависит от родословной.

Тем не менее, даже при относительно высокой цене представители разновидности Мангала достаточно востребованы. Если один раз раскошелиться и приобрести несколько особей, то в дальнейшем их можно без проблем разводить самостоятельно. Еще один минус — требования к площади для содержания: для крупногабаритных свиней нужны большие площади для выгула.

Требования к свиньям

Для содержания свиней мангальной породы требуется большое помещение.Площадь будет зависеть от поголовья скота. Для комфортного проживания человеку необходимо 5 квадратных метров. Многие говорят, что мангалов можно держать на улице даже зимой, но животным все же нужно прятаться от мороза, особенно если это маленькие поросята.

Особое внимание следует уделить укладке пола. Для небольшого количества свиней можно сделать земляную насыпь и уложить ее поверх доски. Для крупного поголовья лучший вариант — бетонное покрытие щелей. Не рекомендуется выбирать для пола пористый материал: он будет впитывать продукты жизнедеятельности животных, что усугубит запах.При укладке пола нужно соорудить желоба для отвода фекалий мочи и мочи.

Очень важно организовать хорошую вентиляцию помещения. В основном используются приточно-вытяжные конструкции. Немаловажную роль играет и освещение: в слишком освещенных помещениях свиньи становятся беспокойными. Количество окон будет напрямую зависеть от площади пола.

В свинарнике нужно организовать подачу воды. Это необходимо для соблюдения гигиенических норм и значительно упростит уборку, особенно если вы сделаете пол под небольшим уклоном.Температура воздуха зимой не должна опускаться ниже нуля. Мангалы отличаются хорошей невосприимчивостью, поэтому установка отопительного оборудования не требуется.

Заключение

Более подробную информацию Вы можете узнать из видео — порода свиней-мангалов.

Такие свиньи имеют огромные преимущества перед другими видами. Их разведение не требует особых затрат, ведь даже при больших габаритах корма они потребляют намного меньше по сравнению с другими сортами.Мангальные свиньи быстро набирают вес. Взрослый кабан достигает 300 кг.

При разведении свиней мангала на мясо необходимо проводить резекцию половых желез. Эта процедура значительно ускоряет набор веса и улучшает качество мяса. Размерным животным нужны большие площади для выгула.

Купить чистокровного поросенка породы мангал довольно проблематично. К сожалению, особи красного, смешанного и черного окрасов оказались на грани исчезновения. В основном выращивают их на крупных свинофермах.Стоимость поросят этого вида очень высока.

Лабораторное определение Clostridium difficile у поросят в Австралии

Реферат

Clostridium difficile — хорошо известный энтерический патоген человека и возбудитель высокозаболевательного энтерита у поросят в возрасте от 1 до 7 дней. Распространенность C. difficile у австралийских поросят достигает 70%. Текущие диагностические тесты были валидированы только для инфекций человека, и нет опубликованных исследований, оценивающих их эффективность у австралийских поросят.Мы оценили пригодность пяти анализов для обнаружения C. difficile в 157 образцах фекалий поросят. Анализы включали петлевой изотермической амплификации (LMIA) -PCR для tcdA (illumigene C. difficile ; Meridian), ПЦР в реальном времени для tcdB (GeneOhm Cdiff; Becton Dickinson), двухкомпонентного фермента. иммуноанализы (EIA) на C. difficile, глутаматдегидрогеназы (GDH) (EIA-GDH) и TcdA / TcdB (EIA-TcdA / TcdB) (C. diff Quik Chek; Alere) и прямое культивирование (DC) ( C .difficile chromID агар; bioMérieux). Анализы для обнаружения микроорганизмов сравнивали с накопительной культурой (EC), а анализы для обнаружения токсинов / генов токсинов сравнивали с EC с последующей ПЦР для генов токсинов (токсигенные EC [TEC]). Извлечение C. difficile с помощью EC составило 39,5% ( n = 62/157), и TEC показала, что 58,1% ( n = 36/62) изолятов были положительными по крайней мере по одному гену токсина ( tcdA / tcdB ). По сравнению с таковыми для EC / TEC чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность были соответственно следующими: DC, 91. 9, 100,0, 100,0 и 95,0%; EIA-GDH: 41,9, 92,6, 78,8 и 71,0%; EIA-TcdA / TcdB: 5,6, 99,2, 66,7 и 77,9%; ПЦР в реальном времени, 42,9, 96,7, 78,9 и 85,4% и LMIA-PCR, 25,0, 95,9, 64,3 и 81,1%. Эффективность молекулярных методов была низкой, что позволяет предположить, что имеющиеся в настоящее время коммерчески доступные анализы для диагностики C. difficile у людей не подходят для использования на поросятах. Восстановление C. difficile с помощью DC обеспечивает экономичную альтернативу.

ВВЕДЕНИЕ

Clostridium difficile сообщается за пределами Австралии как основная причина мышей перед отъемом у новорожденных свиней в возрасте от 1 до 7 дней (1, 2).В США инфекция C. difficile (CDI) является наиболее часто диагностируемой причиной энтерита у новорожденных свиней, при этом смертность, связанная со вспышкой, достигает 50% (1). Хорошее животноводство может снизить смертность; тем не менее, заболеваемость остается высокой, и поросята, выздоравливающие после ИКД, остаются в среднем на 10-15% ниже нормы, и им требуется больше времени для отъема (2).

Как и новорожденные люди, поросята являются гнотобиотиками при рождении, и нормальная микрофлора не устанавливается в желудочно-кишечном тракте примерно до 5-дневного возраста (3).Отсутствие устойчивости к колонизации означает, что поросята особенно восприимчивы к колонизации C. difficile после отела (распространенность до 72% через 2 дня) (4). Все поросята в пораженном помещении для опороса могут быть колонизированы вскоре после рождения, скорее всего, в результате попадания спор из уже зараженной среды свиноводства (4, 5). ИКД свиней характеризуется обильным негеморрагическим, желтым, вязко-водянистым налетом; однако диарея сама по себе не является хорошим предиктором ИКД у отдельных поросят (6, 7).В некоторых случаях поросята не страдают диареей, запором или запором, но при вскрытии обнаруживают колит, тифлит или отек (8, –10).

Токсигенная обогащенная культура (TEC) является предпочтительным «золотым стандартом» для диагностики ИКД человека в лаборатории, поскольку она имеет высокий уровень чувствительности. Он также имеет преимущество выделения изолятов для дальнейшей характеристики и эпидемиологического анализа (11). Наборы для иммуноферментного анализа (EIA), нацеленные на C. difficile, токсины TcdA и TcdB или антиген глутаматдегидрогеназы (GDH), используются как в медицине, так и в ветеринарии (12, 13).Однако эти анализы имеют относительно низкую чувствительность и ограничение перекрестной реактивности с GDH Clostridium sordellii (12). Следовательно, для здоровья человека в настоящее время рекомендуется двухэтапный алгоритм, такой как начальный скрининговый EIA GDH с подтверждающим EIA на токсины или тест амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT), выполняемый для всех положительных анализов (14, 15). Анализы на основе NAAT для обнаружения генов, кодирующих TcdA и TcdB ( tcdA и tcdB , соответственно), с их быстрым временем обработки и высокой чувствительностью, значительно улучшили обнаружение CDI (12).Хотя многие коммерчески доступные анализы для обнаружения C. difficile систематически оценивались для использования на людях, их эффективность с образцами стула животного происхождения не была подтверждена. В настоящее время нет руководств по диагностике ИКД или обнаружению C. difficile у животных. Литература по этой теме скудна и ограничивается несколькими исследованиями в Европе и Северной Америке, в которых сообщалось о различной эффективности анализов для обнаружения C. difficile в фекалиях лошадей (16), собак (17) и свиней (10). , 13, 14, 18).

Исследования в нашей лаборатории подтвердили, что токсигенный C. difficile присутствует во многих стадах свиней в Австралии (Д. Р. Найт, М. М. Сквайр и Т. В. Райли, представленные для публикации). В отличие от Северного полушария, где один риботип ПЦР (RT), RT078, преобладает в стадах свиней (19), в Австралии существует множество различных RT, циркулирующих среди домашнего скота (овцы, крупный рогатый скот и свиньи), включая RT033, RT126, RT127 и RT237 (20, 21). Чтобы понять роль C.difficile при болезни поросят в Австралии, важно, чтобы ветеринарные диагностические лаборатории были в состоянии своевременно и с минимальными затратами обнаруживать этот микроорганизм.

Целью этого исследования было оценить пригодность пяти коммерчески доступных анализов для обнаружения C. difficile в образцах фекалий поросят. (Предварительные результаты этого исследования были представлены на 8-й Международной конференции по молекулярной биологии и патогенезу клостридий [CLOSTPATH], Палм-Коув, Австралия, октябрь 2013 г.)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор проб.

В период с июня 2012 г. по март 2013 г. с помощью ректальных мазков было взято 157 образцов кала у поросят в возрасте <14 дней. Образцы проводились лечащими ветеринарами. На момент отбора пробы 49 поросят (31,2%) активно промывали. Тестовая популяция происходила из 16 ферм (свинарников) в пяти австралийских штатах: Новый Южный Уэльс (NSW), n = 2; Квинсленд (QLD), n = 6; Виктория (ВИК), n = 4; Южная Австралия (SA), n = 1; и Западная Австралия (Вашингтон), n = 3. Фермы различались по типу помещений (например, фермы для опороса, производители и заводчики) и географически различались. Все образцы транспортировали в условиях окружающей среды в транспортной среде Amies с древесным углем (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в Университет Западной Австралии. Среднее время транспортировки от фермы до лаборатории составляло 8 дней (от 2 до 20 дней). Все образцы хранили при 4 ° C и подготовили к анализу в течение 24 часов.

Подготовка проб.

После получения образцов в лаборатории суспензии были приготовлены путем суспендирования фекальных мазков в 800 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).Образцы недолго встряхивали для создания гомогенной суспензии и разделяли на аликвоты по 200 мкл. Две аликвоты использовали для NAAT и хранили при -20 ° C до использования, после чего был реализован один цикл замораживания-оттаивания в соответствии с рекомендациями по анализу. Каждую аликвоту немедленно использовали для накопительного культивирования (EC), EC с последующей ПЦР для генов токсинов (токсигенные EC [TEC]) и прямого культивирования (DC) на chromID. Наконец, одну аликвоту хранили при 2-8 ° C для использования с иммуноферментным анализом и обрабатывали в течение 48 часов.

EC, TEC и идентификация изолята.

Выделение C. difficile было основано на наших ранее описанных методах ЭК (22) с некоторыми модификациями. Образцы фекалий культивировали в бульоне для селективного обогащения, содержащем гентамицин (5 мг / литр), циклосерин (200 мг / литр) и цефокситин (10 мг / литр) (GCC) (PathWest Laboratory Medicine Excel Media, Mt. Claremont, WA). (23, 24). После 48 ч инкубации 1 мл бульона подвергали шокированию спиртом, добавляя равный объем абсолютного этанола для улучшения отбора спор, и 10 мкл субкультивировали на чашки с предварительно восстановленным селективным агаром (агар циклосерин цефокситин с фруктозой [CCFA]), содержащий 0.1% таурохолат натрия (TCCFA) (PathWest Laboratory Medicine Excel Media). Планшеты инкубировали в анаэробной камере (Don Whitley Scientific Ltd., Шипли, Западный Йоркшир, Великобритания) при 37 ° C в атмосфере, содержащей 80% азота, 10% водорода и 10% диоксида углерода, и исследовали через 24 и 48 часов. . Предполагаемые колонии C. difficile субкультивировали на предварительно восстановленный кровяной агар. Во время исследования ни одна из планшетов не находилась вне анаэробной камеры более 15 мин. Подтверждающая идентификация C.difficile был получен на основе характерной морфологии колоний по CCFA (желтый цвет, внешний вид матового стекла), запаху (запах конского навоза) и зеленовато-желтой флуоресценции в длинноволновом УФ-свете (~ 360 нм). Идентичность неопределенных изолятов подтверждали наличием активности l-пролинаминопептидазы (Remel Inc., Lenexa, KS, USA) и окрашиванием по Граму. Способность всех изолятов C. difficile продуцировать токсин A и / или токсин B была определена с помощью ПЦР (см. Ниже), чтобы дать положительный результат TEC.

DC на хромогенном агаре.

ХромИД-агар C. difficile (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Франция) представляет собой хромогенную среду, содержащую таурохолат натрия и запатентованную смесь хромогенов, которая позволяет быстро и надежно изолировать и предположительно идентифицировать штаммов C. difficile в 24 случаях. ч (25, 26). Большинство изолятов C. difficile выглядят как черные колонии на прозрачном фоне (26). Посевы проводили в соответствии с рекомендациями производителя.Планшеты инкубировали в анаэробной камере и идентифицировали, как описано выше.

EIA для GDH и TcdA / TcdB.

C. diff Quik Chek Complete (Alere North America, Inc., Орландо, Флорида) — это быстрый мембранный ИФА для одновременного обнаружения токсинов C. difficile, TcdA и TcdB и GDH в одной реакционной лунке. Все EIA проводились в соответствии с рекомендациями производителя, и результаты регистрировались как положительные или отрицательные для GDH и / или токсинов A / B.

Петлевая изотермическая ПЦР-амплификация для

Анализ амплификации illumigene C. difficile (Meridian Bioscience, Inc., Цинциннати, Огайо) представляет собой NAAT, основанный на принципе петлевой изотермической амплификации (LMIA) -PCR. Этот анализ выявляет токсигенные штаммы C. difficile путем нацеливания на консервативную последовательность 5 ‘204 п.н. tcdA (27). Анализы LMIA-PCR были выполнены на приборе illumipro-10 в соответствии с инструкциями производителя, и результаты были записаны как положительные или отрицательные с использованием программного обеспечения illumipro-10.

Анализ ПЦР в реальном времени для

GeneOhm Cdiff Assay (Becton Dickinson, La Jolla, CA) представляет собой NAAT, использующий технологию ПЦР в реальном времени для амплификации консервативной области tcdB . Амплифицированные продукты обнаруживают с помощью флуорогенных специфичных для мишени гибридизационных зондов (молекулярных маяков). Анализы ПЦР в реальном времени выполняли на SmartCycler (Cepheid, Великобритания; поставлялся Becton Dickinson во время исследования) в соответствии с инструкциями производителя.Программное обеспечение SmartCycler записало результаты анализа ПЦР как положительные, отрицательные или неразрешенные.

Профилирование токсинов и риботипирование с помощью ПЦР для

Все изоляты были проверены с помощью ПЦР на присутствие tcdA и tcdB , бинарных генов токсина ( cdtA и cdtB ) и повторяющейся области tcdA с использованием ранее описанной методологии (28, 30) (28, . ПЦР-риботипирование выполняли, как описано ранее (31).Продукты реакции риботипирования ПЦР концентрировали с использованием набора для очистки ПЦР Qiagen MinElute (Qiagen, Венло, Лимбург, Нидерланды) и запускали на платформе для капиллярного электрофореза QIAxcel (Qiagen). Продукты ПЦР визуализировали в программе QIAxcel ScreenGel v1.0.2.0 (Qiagen). Продукты риботипирования методом ПЦР анализировали с использованием коэффициента Дайса в программном пакете BioNumerics v.6.5 (Applied Maths, Saint-Martens-Latem, Бельгия). RT были идентифицированы путем сравнения паттернов полос с таковыми в нашей справочной библиотеке, состоящей из коллекции наиболее распространенных RT, циркулирующих в настоящее время у людей и животных в Австралии, и коллекции из 15 эталонных штаммов из Европейского центра профилактики и контроля заболеваний (ECDC). ).Изоляты, которые не могли быть идентифицированы с помощью справочной библиотеки, были обозначены внутренней номенклатурой, начинающейся с префикса QX.

Согласующиеся, двусмысленные и противоречивые результаты.

Для анализа, выявляющего организмы (DC и EIA-GDH), результат считался истинно положительным, если он был положительным согласно EC. Для анализа, выявляющего токсин или токсиновые гены (EIA-TcdA / TcdB, ПЦР в реальном времени и LMIA-PCR), результат считался истинно положительным, если положительный по данным TEC. Противоречивые результаты (ложноположительные и ложноотрицательные) в отношении EC / TEC были повторены, как и любые сомнительные или неразрешенные результаты.Процент соответствия EC / TEC рассчитывали для каждого анализа.

Статистический анализ.

Чувствительность и специфичность были рассчитаны для каждого набора в сравнении с анализом золотого стандарта (EC / TEC). Данные о чувствительности и специфичности использовались для расчета положительной (PPV) и отрицательной прогностической ценности (NPV). Точный тест Фишера использовался для сравнения извлечения C. difficile в тестовых системах с извлечением C. difficile EC / TEC.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В целом, C. difficile было выделено EC из 39,5% ( n = 62/157) образцов и с помощью TEC из 22,9% ( n = 36/157) образцов (). Урожайность свиней в разных штатах колебалась от 26,0 до 54,5% (данные не показаны). Выделение изолятов C. difficile от поросят с (36,7%) и без (40,7%) диареей существенно не различались ( P = 0.141). C. difficile был обнаружен в 36,3% ( n = 57/157) образцов с помощью DC, 21,0% ( n = 33/157) образцов с помощью EIA-GDH, 1,9% ( n = 3 / 157) образцов с помощью EIA-TcdA / TcdB, 12,1% ( n = 19/156) образцов с помощью ПЦР в реальном времени и 8,9% ( n = 14/157) образцов с помощью LMIA-PCR ( ).

ТАБЛИЦА 1

Обнаружение C. difficile в фекалиях австралийских поросят ( n = 157)

Target	Assay a				C.difficile результаты анализа:			Соответствие анализа (№ [%])
		№ (%) положительный	№ (%) отрицательный	P	с EC	с TEC
C. difficile	EC	62 (39,5)	95 (60,5)
	DC		0. 56	152/157 (96,8)
	EIA-GDH	33 (21,0)	124 (79,0)	<0,001	114/157 (72,6)	Токсин / ген токсина	TEC	36 (22,9)	121 (77,1)
	EIA-TcdA / TcdA / TcdB
<0,001		122/157 (77.7)
	ПЦР в реальном времени	19 (12,1)	138 (87,9)	0,01		132/156 (84,1) b	14 (8,9)	143 (91,1)	<0,001		125/157 (79,6)

Характеристика

C. difficile

ПЦР показали, что 58,1% ( n = 36) изолятов были положительными по крайней мере по одному токсинному гену ( tcdA / tcdB ).В целом наблюдали пять профилей токсинов, наиболее распространенными из которых были A-положительный, B-положительный, CDT-отрицательный (A ⁺ B ⁺ CDT ^— ) ( n = 33, 53,2%). Два изолята (3,2%) были A ⁺ B ⁺ CDT ⁺ , один (1,6%) был A ^— B ⁺ CDT ^— и пять (8,1%) имели необычный генотип A ^— B ^— CDT ⁺ . Остальные ( n = 21, 33,9%) были отрицательными по каким-либо токсинным генам.Были идентифицированы множественные RT (). Из 62 изолятов, полученных от новорожденных свиней, 32,3% ( n = 20) были назначены один из восьми международно признанных RT. Остальным изолятам был присвоен префикс QX и внутренний номер. Ни RT027, ни RT078 не идентифицированы. QX006 (A ⁺ B ⁺ CDT ^— ) был наиболее распространенной ОТ, обнаруженной в целом, что составляет 16,1% (10/62) изолятов. После QX006 следующими четырьмя наиболее распространенными RT были QX207 (12,9%), QX057 (11,3%), UK014 (11.3%) и QX020 (8,1%).

Сводка риботипов ПЦР и профилей токсинов из выделенных изолятов C. difficile ( n = 62).

Соответствующие и противоречивые результаты.

DC и EIA-GDH согласованности с EC составили 96,8% (152/157) и 72,6% (114/157), соответственно. Комбинированное соответствие для обоих анализов с EC составило 77% (121/157) (). Соответствие ПЦР в реальном времени, EIA-TcdA / TcdB и LMIA-PCR с TEC составило 84,1% (132/157), 77,7% (122/157) и 79,6% (125/157) соответственно.Комбинированная согласованность для всех трех анализов с TEC составила 73,9% (116/157) (). Было большое количество противоречивых результатов, в основном ложноотрицательных, но также и несколько ложноположительных (данные не показаны). Был один сомнительный результат для ПЦР в реальном времени, который не мог быть разрешен после повторного тестирования, что привело к уменьшению общего количества образцов для этого анализа ( n = 156).

Чувствительность, специфичность, PPV и NPV всех анализов по сравнению с EC или TEC.

Распространенность нетоксигенных (A ^— B ^— ) штаммов C.difficile в этом исследовании была высокой (42%). Это наблюдение повысило вероятность смещения популяции в пользу типов штаммов, которые не имеют мишеней (токсин или токсиновые гены), которые разработаны методами, не основанными на культивировании токсинов (EIA-TcdA / TcdB, ПЦР в реальном времени и LMIA-PCR). обнаружить. Чтобы справедливо оценить эти три анализа, их сравнивали с TEC, а анализы для обнаружения организмов (DC и EIA-GDH) сравнивали с EC (). Из всех тестов компаратора DC имел самую высокую чувствительность и специфичность (91.9% и 100,0% соответственно). Чувствительность EIA-GDH составила 41,9% (). Для трех других анализов (EIA-TcdA / TcdB, ПЦР в реальном времени и LMIA-PCR) чувствительность была низкой, от 5,6 до 42,9%, а прогностические значения для всех анализов широко варьировались (диапазон PPV от 64,3 до 100,0%). ; Диапазон NPV от 71,0 до 95,0%) ().

ТАБЛИЦА 2

Производительность DC и EIA-GDH и EIA-TcdA / TcdB, LMIA-PCR и ПЦР в реальном времени по сравнению с EC и TEC, соответственно ^a

Сравнительный тест	Параметр b	Производительность (доверительный интервал 95%)
		DC	EIA-GDH	EIA-TcdA / TcdA / TcdB	9035 PCR
EC	% чувствительности	91.9 (82,2–97,3)	41,9 (29,5–55,2)
	% специфичность	100,0 (96,2–100,0)	92377	92,6 (85,4–97,0)	92,6 (85,4–97,0)
	% PPV	100,0 (93,7–100,0)	78,8 (61,1–91,0)
	% NPV
TEC	% чувствительность			5. 6 (0,8–18,7)	42,9 (26,3–60,6)	25,0 (12,2–42,2)
	% специфичность			99,2 (95,5–99,9)	96,7 (91,7)	95,9 (90,6–98,6)
	% PPV			66,7 (11,6–94,5)	78,9 (54,4–93,8)	64,3 (35,2–87,1)
		77.9 (70,5–84,2)	85,4 (78,4–90,9)	81,1 (73,7–87,2)

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании 157 образцов фекалий поросят оценивались на наличие C. difficile. или его токсинов с помощью EC / TEC, двух методов NAAT (ПЦР в реальном времени и LMIA-PCR), DC с использованием хромогенного агара и EIA для GDH и токсинов A и B. Это первая оценка коммерчески доступных диагностических тестов для обнаружение C. difficile или его токсинов в широком диапазоне C.difficile от австралийских новорожденных свиней. Мы показали, что по сравнению с EC или TEC, EIA и NAAT имеют гораздо более низкую чувствительность, специфичность и прогностическую ценность при использовании для обнаружения C. difficile или его токсинов в фекалиях свиней, а не в человеческих фекалиях (и).

Из 157 образцов, собранных в этом исследовании, 22,9% и 39,5% были положительными на C. difficile по данным TEC и EC, соответственно. Восстановление ЕС похоже на то, что в отчетах из США (34.3%) (32), из Нидерландов (от 42 до 48%) (14) и из менее производящих свинину стран, таких как Словения (50,9%) (33) и Чехия (56,7%) (34). Наша лаборатория ранее обнаружила с помощью EC, что инфекция C. difficile у австралийских новорожденных свиней широко распространена с национальной распространенностью 67% (Knight et al, представленный).

Исследования, проведенные в других странах, оценивали различные методы обнаружения на основе GDH и токсинов у животных, включая поросят (10, 13, 14, 16, –18). Тем не менее, разнообразие популяций штаммов, географическое распределение участков отбора проб и логистика транспортировки образцов, задействованные в нашем исследовании, обеспечивают уникальный сценарий для оценки эффективности этих анализов для выявления ИКД у поросят.На сегодняшний день мало исследований оценивали DC (25, 26, 35), и только одно из них включало образцы животного происхождения; однако это были изолятов C. difficile , а не образцы фекалий (35). В этом исследовании представлены первые опубликованные в мире данные о характеристиках хромогенной среды для выделения C. difficile из образцов фекалий животных. DC показал лучшие результаты из всех сравнительных анализов и имел высокую чувствительность (91,9%) и специфичность (100,0%). Общее восстановление с.difficile по DC был высоким (36,3%) и сопоставимым с EC (39,5%) (соответствие 96,8%). Эти результаты согласуются с исследованиями, проведенными на человеческих фекалиях (25, 35).

Обнаружение токсигенного и нетоксигенного C. difficile в фекалиях свиней с помощью анализов на основе токсинов и молекул (EIA-TcdA / TcdB, ПЦР в реальном времени и LMIA-PCR) было плохим. Соответствие этих анализов с TEC было ниже ожидаемого (EIA-TcdA / TcdB, 77,7%; ПЦР в реальном времени, 84,1%; и LMIA-PCR, 79.6%), а чувствительность колебалась от 5,6 до 42,9%. Удивительно, но учитывая высокую распространенность C. difficile в популяции, PPV и NPV для анализов на основе NAAT (ПЦР в реальном времени и LMIA-PCR) были неприемлемо низкими (PPV, 78,9% и 64,3%, соответственно; NPV — 85,4% и 81,1% соответственно). Этот результат согласуется с результатами других исследований, которые показали, что эффективность анализов на основе NAAT для обнаружения C. difficile в образцах фекалий свиней, лошадей и собак была меньше, чем в образцах фекалий человека (10, 14, 17 ).

Низкая эффективность всех анализов, кроме DC, в первую очередь объясняется большим количеством противоречивых результатов, в основном ложноотрицательных, и это может быть связано с рядом факторов. Было предложено несколько факторов окружающей среды и хозяина, которые, как считается, влияют на эффективность диагностических тестов на людях, которые могут иметь значение при исследованиях на животных. Во-первых, исследование Lyerly показало, что низкая специфичность иммуноферментных анализов может быть связана с деградацией токсина из-за нескольких циклов замораживания-оттаивания (36).Маловероятно, что это объясняет противоречивые результаты, полученные в нашем исследовании, поскольку образцы размораживали только один раз, в соответствии с рекомендациями производителя. Во-вторых, Jure и его коллеги предположили, что неспецифическое связывание фекальных белков хозяина с токсином в желудочно-кишечном тракте приводит к низким уровням свободного несвязанного токсина в образце (влияя на иммуноферментные анализы [ELISA] и цитотоксические анализы) (37). В-третьих, низкая специфичность, наблюдаемая при коммерческом тестировании фекалий животных, потенциально вызвана присутствием ингибирующих веществ или инактивирующих ферментов (10, 36).На сегодняшний день в литературе имеется ограниченное количество данных, подтверждающих эту гипотезу; однако можно предположить, что внутренние различия в составе фекалий между животными и людьми влияют на связывание праймеров или антигенов в случае EIA. Если присутствуют ингибирующие вещества, они могут быть специфичными для определенных белков и могут объяснять противоречивые результаты EIA, наблюдаемые в этом исследовании, где образцы, которые дали токсин-положительные изоляты, были зарегистрированы с помощью EIA как GDH-положительные или TcdA или TcdB-отрицательные.Наконец, Гумерлок и др. предположили, что фекальные протеазы снижают уровень токсинов в стуле (38). Возможно, что время, в течение которого образцы находились в пути (среднее время транспортировки 8 дней), оказало пагубное влияние на уровни токсинов в кале, снизив их до уровня ниже уровня обнаружения анализов на основе EIA. Этим можно объяснить разницу между плохими результатами, представленными здесь для ОВОС, и результатами, полученными Кессеном и его коллегами (от 80 до 90%) (14). В этом исследовании фекалии свиней были собраны в апреле (европейская весна) и транспортированы в холодильнике с ферм в относительно небольшой географической зоне Нидерландов (~ 1/200 размера Австралии).В нашем исследовании образцы транспортировались на большие расстояния (среднее расстояние от фермы до лаборатории ~ 3600 км) и в неоптимальных (окружающих) условиях хранения. Это важное наблюдение, которое, вероятно, отражает обстоятельства, при которых образцы обычно транспортируются из места сбора в ветеринарную лабораторию. Тот факт, что DC так хорошо работал в этих условиях, подчеркивает его пригодность в качестве диагностического теста для C. difficile в Австралии.

Важно, чтобы диагностические тесты работали хорошо, независимо от типов штаммов, присутствующих в исследуемой популяции.Это исследование идентифицировало многочисленные риботипы ПЦР, некоторые из которых были всемирно известными штаммами, преимущественно ОТ, ассоциированными с носительством и заболеванием у людей. Наиболее распространенным RT был QX006 (16,1%), за ним следовали QX207 (12,9%), UK014 (11,3%), QX057 (11,3%) и UK020 (8,1%). Эти пять лучших RT составили 60% изолятов, извлеченных с помощью TEC. RT014 и RT020 часто группируются вместе из-за их очень схожих отпечатков риботипа ПЦР. RT014 / 020 — наиболее распространенный RT во многих странах, включая Нидерланды (39) и Австралию (B.Эллиотт и Т. В. Райли, неопубликованные данные). RT014 не только хорошо зарекомендовал себя при нозокомиальных случаях ИКД, но также является ведущей причиной заболевания в сообществе (39) и был обнаружен у небольшого количества домашнего скота (40). RT046 составлял приблизительно 5% изолятов и недавно был описан в популяциях поросят и человека в Швеции (41). Распределение ОТ выглядело клональным со многими ОТ, уникальными для отдельных хозяйств и штатов (данные не показаны), и согласуется с нашими выводами в недавнем исследовании (Knight et al., Отправлено).

В целом 58% ( n = 36) изолятов были положительными по tcdA или tcdB или обоим. Из оставшихся изолятов 34% ( n = 21), в том числе около половины изолятов, входящих в пятерку лучших ОТ, были нетоксигенными (A ^— B ^— CDT ^— ) штаммами и 8,1% ( n = 5) изолятов были положительными только на бинарный токсин (CDT ⁺ ). Эти данные указывают на неоднородность исследуемой популяции и согласуются с нашими выводами в недавнем исследовании (Knight, представлено).

Из ограниченного числа диагностических исследований, проведенных на животных на сегодняшний день, единственное исследование Keessen et al. предоставили данные типирования, указывающие на гомогенность штаммов C. difficile в их тестовой популяции (14). В этом исследовании 99% (70/71) изолятов, выделенных из образцов фекалий свиней, были RT078, преобладающим RT, циркулирующим у животных в Европе. В том же исследовании сообщается о значительно более высокой чувствительности анализа ПЦР в реальном времени и ряда платформ EIA. Возможно, что их результаты были искажены из-за популяции одного штамма. В частности, могут быть различия в антигенных свойствах, экспрессии токсина или сайтах связывания праймеров локуса патогенности (PaLoc). Эта идея также была предложена Tenover et al., Которые обнаружили значительно более низкую чувствительность с помощью ПЦР в реальном времени и EIA для RT078, чем для многих других риботипов, включая эпидемический штамм RT027 (42). RT078 не был обнаружен ни в этом, ни в каких-либо предыдущих исследованиях австралийского домашнего скота, и RT078 также не является эндемичным для популяций человека в Австралии (43).

В нашем исследовании DC стабильно хорошо себя показал во всех 19 RT.Этот результат согласуется с выводами Eckert et al. (25), которые не обнаружили взаимосвязи между риботипом ПЦР и извлечением изолята с использованием хромогенного агара. И наоборот, все методы, не относящиеся к культивированию, оцениваемые в этом исследовании (EIA-GDH, LMIA-PCR, ПЦР в реальном времени и EIA-TcdA / TcdB), показали стабильную низкую эффективность во всех 12 токсигенных RT.

На эффективность любого анализа в конечном итоге влияет выбор эталонного метода. EC / TEC обладают не только высокой чувствительностью и специфичностью к C.difficile , но также выгода от извлечения изолята, которая может быть использована для будущего эпидемиологического типирования и тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (11). EC / TEC, однако, медленные и трудоемкие, для завершения часто требуется до 5 дней и вряд ли будут приняты ветеринарными лабораториями в качестве стандартной практики для тестирования C. difficile . Мы показали, что DC представляет собой подходящий метод предполагаемой идентификации для ветеринарных лабораторий. Пластины chromID Cdiff очень селективны; они ограничивают рост эндогенной флоры, так что C.difficile легко идентифицировать и субкультивировать перед профилированием токсинов и эпидемиологическим типированием. ДК превзошли молекулярные методы, оцененные в этом исследовании, а также ЭК на TCCFA, исключив необходимость предварительного восстановления, алкогольного шока или дополнительных 24 часов инкубации (26). Другими преимуществами этой среды являются ее относительно низкая стоимость (чашки стоят около 3 австралийских долларов каждая), а среда, необходимая для роста C. difficile , может быть относительно легко достигнута с помощью анаэробных сосудов.

Это исследование подчеркивает высокую распространенность и уникальные типы штамма C. difficile , присутствующие в популяциях австралийских новорожденных свиней. Несмотря на низкую эффективность коммерчески доступных диагностических тестов, не основанных на культуре, это исследование показывает, что DC представляет собой жизнеспособный вариант для обнаружения C. difficile у поросят. В условиях больницы противоречивые результаты тестов имеют серьезные последствия для лечения пациентов. Ложноположительные результаты могут привести к ненужному лечению и изоляции, а ложноотрицательные результаты увеличивают риск задержки с лечением и перекрестного заражения (44).Диагностика ИКД у поросят может быть не столь критичной по времени, но наши результаты подчеркивают важность разработки экономичных, чувствительных и специфических анализов для быстрого и надежного обнаружения C. difficile и его токсинов в фекалиях свиней.

Тифлоколит, связанный с риботипами Clostridium difficile 078 и 110 у новорожденных поросят из коммерческого ирландского стада свиней | Irish Veterinary Journal

Четыре поросенка 3-4-дневного возраста, погибшие во время вспышки высокой заболеваемости, низкой смертности и неонатальной диареи в коммерческом поголовье свиней на 1000 свиноматок, были отправлены на вскрытие.Подробная информация о лечении до смерти не была доступна.

При общем вскрытии все четыре туши были хорошо сохранены с адекватными запасами телесного жира. Желудки были наполнены молоком. Был умеренный отек толстой кишки, содержимое тонкой кишки и толстой кишки было мягким и желтым во всех четырех. Грубых изменений слизистой оболочки кишечника, слепой кишки или толстой кишки не отмечено. Остальные системы организма ничем не примечательны.

Гистопатология

По меньшей мере 6 срезов из репрезентативных областей по длине тонкой кишки, срез слепой кишки и по меньшей мере шесть срезов спиральной ободочной кишки были взяты для гистопатологии. Их фиксировали в забуференном формалине, регулярно обрабатывали и окрашивали гематоксилином и эозином.

При гистопатологическом исследовании у трех поросят был обнаружен мультифокальный поверхностный фибринозно-гнойный и эрозивный колит от легкой ( n = 1) до тяжелой ( n = 2) степени с нейтрофилами и фибрином, просачивающимися из собственной пластинки через эрозированный эпителий. просвет («вулканические очаги») (рис. 1). У другого поросенка был умеренный многоочаговый гнойный мезоколит.Кроме того, у двух поросят был острый негнойный поверхностный энтерит легкой степени тяжести с поверхностным некрозом и микротромбозом у одного из поросят. У всех четырех поросят также был атрофический энтерит легкой степени.

Рис. Двоеточие. a Нормальная толстая кишка выстлана столбчатыми эпителиальными клетками. b Поверхностный эрозивный колит с инфильтрацией нейтрофилов в собственную пластинку и излияние в просвет — «вулканическое поражение» ( стрелка ) (гематоксилин и эозин 20 ×)

С.

Содержимое толстой кишки было положительным на токсинов C. difficile A / B с использованием набора Premier Elisa Kit Toxins A&B (Meridian Bioscience Inc.)

Пятнадцать мкл содержимого толстой кишки обрабатывали 50 мкл (96 %) спирт этиловый. Пятнадцать мкл каждой смеси переносили индивидуально в планшеты, содержащие среду цефокситин циклосерин яичный желток Брейзера (CCEY) (Lister, 2014). Планшеты инкубировали в анаэробных условиях (10% H ₂ , 10% CO ₂ и 80% N ₂ ) при 34 ° C в течение 48 часов.Колонии «битого стекла», типичные для C. difficile , переносили в чашки с кровяным агаром и инкубировали еще 48 часов. Хелатирующую смолу Chelex-100 использовали для экстракции цельноклеточной ДНК из полученных колоний. ПЦР-амплификацию ДНК проводили с мастермиксом BioMix Red (Bioline) и праймерами CD-16s, 5′-CTG GGG TGA AGT CGT AAC AAG G-3 ‘, 6′-GCG CCC TTT GTA GCT TGA CC-3’ ( Eurofins MWG). Продукты ПЦР переносили в нагревательный блок, установленный на 75 ° C, на 45 мин для концентрирования продуктов до c.20 мкл перед электрофорезом в 3% агарозном геле с окрашиванием нуклеиновой кислотой GelGreen (Biotium). Гель помещали под ультрафиолетовое излучение в закрытую камеру Bio-Rad Universal Hood II. Результаты визуализировали с помощью программного обеспечения для одномерного анализа Bio-Rad Quantity One (4-6-1). ПЦР-риботипы были успешно получены для трех поросят; два были риботипом 078, а один — риботипом 110. Образец четвертого поросенка не дал чистой культуры после обработки 96% этанолом и анаэробной инкубации со средой CCEY.

Другие лабораторные исследования

Clostridium perfringens ( C. perfringens ) выделяли путем прямого анаэробного культивирования кишечного содержимого с использованием предварительно восстановленного 5% агара с колумбийской овечьей кровью (SBA) и требовательного анаэробного кровяного агара с неомицином (E&O Laboratories, Шотландия). C. perfringens альфа-токсин был обнаружен в объединенном образце содержимого тонкой кишки с помощью сэндвич-ELISA, тестирования на альфа (α), бета (β), эпсилон (ɛ) токсины и C.perfringens Antigen (BioX Diagnostics, Бельгия).

Ротавирус группы В был обнаружен в содержимом тонкой кишки у двух поросят с использованием модифицированных версий ранее описанных методов ПЦР [7, 8]. ПЦР на коронавирусы свиней и репродуктивный и респираторный вирус свиней дали отрицательный результат с использованием модифицированных версий ранее описанных методов [9–12]. Антиген не был обнаружен с использованием моноклонального антитела против Cryptosporidium parvum , меченного флуоресцеинизотиоцианатом (Bio-X Diagnostics, Бельгия, каталожный номер BIO 073).

Границы | Генетическое родство между японскими и европейскими изолятами Clostridium difficile, происходящими от поросят, и их риск, связанный со здоровьем человека

Введение

Clostridium difficile — это грамположительная спорообразующая анаэробная бактерия, вызывающая у людей диарею, связанную с антибиотиками, и псевдомембранозный колит. Большинство патогенных штаммов C. difficile продуцируют два сходных по структуре токсина, токсин A и токсин B, основные детерминанты вирулентности, связанные с C.difficile . C. difficile часто выделяют от пациентов и сельскохозяйственных животных (Keessen et al., 2011). Хотя передача зоонозов остается предположительной, мясные продукты могут быть обычным источником инфекции C. difficile у людей, а животные, производящие пищу, также могут служить резервуаром.

За последнее десятилетие инфекции C. difficile стали более распространенными и более серьезными в развитых странах, включая Японию (Rupnik et al., 2009; Honda et al., 2014). Недавние отчеты показали, что увеличение бремени C. difficile вызвано быстрыми изменениями в глобальной эпидемиологии с появлением эпидемического штамма C. difficile . Штамм PCR риботип 027 (BI / NAP1) был первоначально обнаружен в Северной Америке, а затем наблюдался в европейских странах, Австралии и некоторых странах Азии (Richards et al. , 2011; Collins et al., 2013; Knight et al. , 2013). Кроме того, распространенность риботипа 078 ПЦР, штамма, обычно встречающегося у свиней, увеличилась с 2006 года и в настоящее время является одним из наиболее распространенных типов в европейских странах (Bauer et al., 2011). В некоторых отчетах подчеркивается высокий уровень родства, существующий между изолятами C. difficile PCR риботипа 078 как от человека, так и от свиней, с использованием высокодискриминационных методов типирования, таких как анализ тандемных повторов с переменным числом множественных локусов (MLVA; Debast et al. др., 2009; Баккер и др., 2010). В Японии риботип 027 PCR наблюдался только в единичных случаях, а риботип 078 PCR не был обнаружен, в отличие от Европы и Северной Америки (Collins et al., 2013).ПЦР риботип 018 (smz) является наиболее распространенным изолятом, обнаруженным в случаях случаев инфекции C. difficile у людей в Японии (Collins et al., 2013). Для оценки риска для здоровья человека важно определить бактериальные свойства изолятов C. difficile свиней, такие как токсигенность, генотип и чувствительность к антимикробным препаратам, и сравнить их с таковыми изолятов человека.

Целью данного исследования было выяснить риск для здоровья человека, связанный с C.difficile , присутствующие в популяции свиней в Японии. Ранее мы пытались выделить C. difficile от 250 убойных свиней; однако C. difficile был выделен только из двух образцов фекалий (Asai et al., 2013). C. difficile чаще выделяется от новорожденных поросят, а не от убойных свиней (Hopman et al., 2011). Кроме того, нет четкой связи между выделением C. difficile и неонатальной диареей свиней (Alvarez-Perez et al., 2009). Поэтому мы выделили C. difficile от клинически нормальных поросят, чтобы выяснить текущий статус C. difficile в Японии. Мы оценили токсигенность и чувствительность к противомикробным препаратам изолятов C. difficile и определили родство C. difficile , происходящих от поросят, человеческих клинических изолятов и чужеродных изолятов, анализируя их молекулярные характеристики.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и образцы кала

Всего было собрано 120 образцов фекалий новорожденных поросят в возрасте до 20 дней.Эти образцы были собраны на 12 фермах (10 поросят от разных свиноматок / фермы) в течение июня – августа 2012 года в семи разных префектурах Японии. На момент отбора проб у поросят не было симптомов диареи.

В этом исследовании использовались два изолята C. difficile , полученные от убойных свиней в Японии (Asai et al., 2013). Семьдесят три клинических изолята C. difficile , которые были получены в период с 2002 по 2005 год в двух токийских больницах (Oka et al., 2012) также использовались в этом исследовании для сравнения их чувствительности к противомикробным препаратам и генетического родства с изолятами свиней. C. difficile. штаммов 9689, 43593, 700057, BAA-1870 и BAA-1875 были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC; Манассас, Вирджиния, США) в качестве эталонных штаммов.

Питательные среды

Clostridium difficile выделено из образцов фекалий, обработанных спиртом для отбора спор, как описано ранее (Asai et al., 2013), культивировали на агаре циклосерин-цефокситин-маннитол (CCMA) -Ex (Nissui Pharmaceutical, Токио, Япония) при 37 ° C в течение 36–48 ч в анаэробных условиях. Выделенные колонии очищали повторным разделением на CCMA-Ex с последующей анаэробной инкубацией, как указано выше. Для каждого образца фекалий максимум три колонии были идентифицированы как C. difficile на основании морфологии колонии, а затем были проанализированы дополнительно.

Идентификация и обнаружение токсиновых генов

экстрагировали с использованием коммерческого набора (InstaGene Matrix, BioRad, Hercules, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфическим набором праймеров (таблица 1; Kikuchi et al., 2002) использовалась для подтверждения идентификации бактерий. Наличие генов, кодирующих токсин A, B и бинарный токсин ( tcdA, tcdB и cdtA / B , соответственно), анализировали с помощью мультиплексной ПЦР, как описано ранее (Persson et al. , 2008). Последовательности праймеров перечислены в таблице 1. Для исследования делеции 3′-конца в tcdA была проведена дополнительная ПЦР, как описано ранее (Kato et al., 1999) с использованием праймеров (таблица 1).

ТАБЛИЦА 1. Праймеры, использованные в настоящем исследовании.

ПЦР-риботипирование

Риботипирование с помощью полимеразной цепной реакции проводили, как описано ранее (Stubbs et al., 1999; Oka et al., 2012). Вкратце, объем смеси для ПЦР был уменьшен с 50 до 15 мкл, а амплифицированные продукты ПЦР были сконцентрированы до конечного объема приблизительно 10 мкл путем нагревания при 75 ° C в течение 90–120 мин. Электрофорез в 3% метафора агарозе (Lonza Rockland Inc., Базель, Швейцария) при постоянном напряжении 120 В в течение 4 ч. Паттерны полосатости риботипирования методом ПЦР анализировали с использованием программы BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия). Сходство и разнообразие оценивали с помощью коэффициента Дайса. Кластерный анализ выполняли с использованием метода невзвешенных пар с алгоритмом среднего арифметического.

Тест на чувствительность к противомикробным препаратам

Мы провели определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) с использованием метода разбавления агара в соответствии с рекомендациями Института клинических лабораторных стандартов [CLSI] (2007).Проверяли чувствительность к ванкомицину, метронидазолу, клиндамицину, цефтриаксону, эритромицину и ципрофлоксацину (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Пределы устойчивости к метронидазолу, клиндамицину и цефтриаксону были приняты в соответствии с рекомендациями CLSI (Институт клинических лабораторных стандартов [CLSI], 2007). Контрольные точки для ванкомицина, эритромицина и ципрофлоксацина, которые не определены в рекомендациях CLSI, были выбраны, как описано в предыдущем отчете Oka et al. (2012). C. difficile ATCC700057 использовали в качестве штамма контроля качества. Чувствительность к противомикробным препаратам 73 человеческих клинических изолятов C. difficile была определена с помощью теста E Oka et al. (2012) и методом разведения в агаре для сравнения МИК клинических изолятов свиней и людей.

Характеристика ПЦР-риботипа 078 изолятов

Токсинотип всех изолятов ПЦР риботипа 078 определяли методом, описанным Rupnik et al. (2001). Последовательность tcdC всех изолятов ПЦР риботипа 078 определяли, как описано Spigaglia и Mastrantonio (2002).

Тандемно-повторяющийся анализ множественных локусов переменных (MLVA)

MLVA всех изолятов ПЦР риботипа 078 определяли оптимизированным методом MLVA на основе шести локусов (Bakker et al., 2010). ПЦР проводили, как описано Bakker et al. (2010). Для подтверждения количества тандемных повторов продукт ПЦР секвенировали напрямую. Амплифицированный продукт очищали с помощью набора FastGene Gel / PCR Extraction Kit (Nippon Genetics, Tokyo, Japan) и секвенировали в обоих направлениях с использованием тех же праймеров, которые использовались в ПЦР.Нуклеотидные последовательности определяли с использованием набора для циклического секвенирования BigDye Terminator, версия 3.1 с автоматическим секвенатором ДНК (ABI 3130; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Число тандемных повторов в каждом локусе определяли вручную с помощью программного обеспечения BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). Номера копий мотивов в тандемном массиве были импортированы в программное обеспечение BioNumerics (Applied Maths), а минимальное остовное дерево было сгенерировано с использованием категориального коэффициента программного обеспечения.Мы сравнили профили MLVA наших изолятов ПЦР риботипа 078 и чужеродных изолятов ПЦР риботипа 078, полученных от свиней и людей (Bakker et al., 2010).

Результаты

Выделение

образцов фекалий от 120 поросят, и C. difficile было выделено только из подгруппы этих поросят. Когда два или три изолята из образца кала демонстрировали одинаковый риботип ПЦР и чувствительность к антимикробным препаратам, их считали одним изолятом.Тридцать девять изолятов были получены из 39 образцов, 58 изолятов были получены из 29 образцов (по два изолята из каждого образца) и три изолята были получены из одного образца (три изолята из одного образца). Всего было идентифицировано 100 изолята C. difficile . C. difficile был выделен из 69 (57,5%) из 120 образцов, полученных от 11 (91,7%) из 12 хозяйств (таблица 2).

ТАБЛИЦА 2. Выделение и профиль токсинового гена Clostridium difficile от японских поросят.

Профиль гена токсина

Токсиновый профиль изолятов C. difficile исследовали с помощью ПЦР. Из 100 изолятов C. difficile 61,0% (61/100) были положительными для tcdA и tcdB (токсин A ⁺ B ⁺ ), среди которых 42,6% (26/61) были также положительный по бинарным токсиновым генам ( cdtA и cdtB ; CDT ⁺ ; Таблица 2). Делеция 3′-конца в tcdA не была обнаружена у всех 61 штаммов, положительных по tcdA .Тридцать девять изолятов (39,0%) были отрицательными для tcdA , tcdB , cdtA и cdtB (токсин A ^— B ^— CDT ^— ). Один изолят C. difficile , полученный от убойной свиньи (12EN), также был положительным в отношении tcdA и tcdB (токсин A ⁺ B ⁺ ) методом мультиплексной ПЦР (Persson et al., 2008 ), хотя изолят был положительным только для tcdB , как было определено с использованием набора праймеров, описанного Kato et al.(1998). Делеция в tcdA , которая комплементарна праймеру NK11, который был использован для амплификации гена tcdA в предыдущем отчете Asai et al. (2013). Изолят 12EN также оказался положительным по генам бинарных токсинов. Другой изолят, полученный от убойной свиньи (134C1), был отрицательным по токсинам A, B и бинарному токсину (Toxin A ^— B ^— CDT ^—).

Чувствительность к противомикробным препаратам

МИК ₅₀ с, МИК ₉₀ с и диапазон МИК ванкомицина, метронидазола, клиндамицина, цефтриаксона, эритромицина и ципрофлоксацина для 100 C.difficile (таблица 3). Все изоляты были чувствительны к ванкомицину и метронидазолу. Устойчивость к клиндамицину, цефтриаксону, эритромицину и ципрофлоксацину была обнаружена у 59, 6, 46 и 75% изолятов соответственно. Из 61 токсигенного изолята C. difficile (Toxin A ⁺ B ⁺ ) частота устойчивости к клиндамицину, цефтриаксону, эритромицину и ципрофлоксацину составила 71, 10, 43 и 74% соответственно. Процент резистентных изолятов, полученных от поросят, ко всем противомикробным препаратам, особенно цефтриаксону, был ниже, чем у людей, клинически выделенных (Oka et al., 2012).

ТАБЛИЦА 3. Антимикробная чувствительность изолятов поросят Clostridium difficile и клинических изолятов человека.

Генотипирование

Все 100 изолятов подвергались риботипированию с помощью ПЦР и были разделены на 14 риботипов ПЦР (рис. 1; таблица 4). Основными риботипами ПЦР изолятов C. difficile были P1 (34 изолята), P2 (20 изолятов) и P3 (12 изолятов). Образцы полос для ПЦР-риботипа P2 и ПЦР-риботипа P3 были идентичны таковым для ATCC 700057 (PCR-риботип 038) и ATCC BAA-1875 (PCR-риботип 078), соответственно.Образцы полос 134C1 и 12EN, которые были получены от убойных свиней (Asai et al., 2013), были идентичны риботипу Р2 и Р3 ПЦР, соответственно. Ни один из ПЦР-риботипов изолятов C. difficile от поросят не был идентичен таковым из клинических изолятов человека из Японии (Oka et al., 2012) или эталонным штаммам C. difficile ATCC 9689 (ПЦР-риботип 001), ATCC 43593 (риботип 060 PCR) и ATCC BAA-1870 (риботип 027 PCR).

ТАБЛИЦА 4.Связь между риботипом ПЦР и профилем токсинового гена.

РИСУНОК 1. Профили риботипов полимеразной цепной реакции (ПЦР) штаммов Clostridium difficile , выделенных от поросят, убойных свиней и людей. Анализ паттерна риботипирования ПЦР проводили с применением коэффициента Дайса. В этом исследовании было выделено шестьдесят девять изолятов от поросят. Ранее были выделены два изолята от убойных свиней и 73 изолята от человека (Oka et al., 2012; Асаи и др., 2013). Штаммы АТСС использовали в качестве контрольных.

Характеристика ПЦР-риботипа 078 изолятов

Все 12 штаммов C. difficile PCR риботипа 078 принадлежали к токсинотипу V. Было обнаружено, что все 12 штаммов C. difficile PCR риботипа 078 содержат делецию 39 пар оснований в гене регулятора токсина ( tcdC ). Один изолят C. difficile PCR риботипа 078, полученный от убойной свиньи (12EN), принадлежал к токсинотипу VI.Этот изолят также содержит делецию из 39 пар оснований в tcdC .

MLVA

В предыдущем отчете MLVA исследовали 102 и 56 штаммов C. difficile PCR риботипа 078 человека и свиней, соответственно, из четырех европейских стран (Bakker et al., 2010). Крупнейшие генетически связанные кластеры (GC) содержали 103 линии, включая 47 линий свиней и 56 линий человека. В этом исследовании все штамма C. difficile PCR риботипа 078 от 12 поросят и одной убойной свиньи также принадлежали к крупнейшим GC (Рисунок 2; Таблица 5).

ТАБЛИЦА 5. Для каждого штамма результаты оптимизированного MLVA для каждого из 7 локусов.

РИСУНОК 2. Анализ минимального остовного дерева изолятов риботипа 078 C. difficile PCR с помощью анализа тандемных повторов по множеству локусов переменных (MLVA). Каждый тип MLVA обозначается одним узлом или концом ветви, отображаемым в виде круга, соединенного ветвями минимального остовного дерева. Длина ветвей представляет собой генетические расстояния.Цвета указывают на происхождение изолятов (европейские люди: зеленые; европейские свиньи: красные; японские поросята: фиолетовые; японские убойные свиньи: желтые). Европейские изоляты, полученные из четырех европейских стран, были исследованы в предыдущем отчете Bakker et al. (2010).

Обсуждение

Мы продемонстрировали высокую распространенность C. difficile у клинически нормальных поросят (57,5%), несмотря на предыдущее выделение только двух штаммов от убойных свиней (0,8%) в Японии (Asai et al., 2013). Hopman et al. (2011) предположили, что поросята приобретают C. difficile вскоре после рождения. Предыдущее исследование показало, что поросята заражаются C. difficile в результате загрязнения окружающей среды в стойлах для опороса (Hopman et al., 2011). Также сообщалось о значительном снижении скорости колонизации C. difficile с возрастом Norman et al. (2009). ПЦР-риботипы двух изолятов убойных свиней (Asai et al., 2013) принадлежали двум доминирующим ПЦР-риботипам, обнаруженным среди линий поросят (P2 и P3; рис. 1).Хотя распространенность C. difficile была относительно низкой у убойных свиней, присутствие здоровых свиней, несущих этот патоген, на бойнях представляет значительный потенциал для заражения мяса и последующего заражения человека (Weese et al., 2011).

Текущее исследование показало, что из одного образца можно выделить несколько штаммов. Во многих случаях каждый из этих изолятов давал разные риботипы ПЦР. Эти результаты предполагают, что различные типы C.difficile может сосуществовать в кишечнике поросят. Наиболее распространенным риботипом ПЦР в этом исследовании был P1. Этот риботип показал несколько профилей токсиновых генов. Ранее один риботип ПЦР указывал на тот же профиль токсинового гена, за исключением редкого случая (Martin et al., 2008). Вторым по распространенности риботипом Р2 для ПЦР был нетоксигенный риботип 038 для ПЦР. О распространенности этого риботипа у поросят в других странах не сообщалось. В европейских странах ПЦР-риботип 078, полученный от поросят, был наиболее распространенным ПЦР-риботипом (Keel et al., 2007; Хопман и др., 2011; Schneeberg et al., 2013). Эти результаты предполагают, что распространение этого риботипа ПЦР в Японии было уникальным. Хотя профиль токсинового гена P1 был необычным, этот риботип необходимо отслеживать у японских свиней.

Это исследование продемонстрировало, что токсигенные C. difficile (токсин A ⁺ B ⁺ ) были изолированы с высокой распространенностью (61,0%) от поросят в Японии. Бинарные гены токсина, которые влияют на тяжесть инфекции (Bacci et al., 2011), были обнаружены у 26% изолятов. Некоторые изоляты C. difficile также были устойчивы к испытанным антимикробным препаратам, которые связаны с антибиотико-ассоциированной диареей, вызванной C. difficile (Bartlett and Gerding, 2008). При сравнении чувствительности к противомикробным препаратам изолятов поросят и клинических изолятов человека, уровень устойчивости изолятов поросят был ниже, чем у клинических изолятов человека. Эти данные свидетельствуют о том, что клинические изоляты человека часто подвергаются воздействию противомикробных препаратов в клинической практике, что приводит к более высокому уровню устойчивости.Более того, низкий процент устойчивости к цефтриаксону (6,0%) у изолятов свиней, вероятно, связан с редким использованием цефалоспорина у свиней (Министерство сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства [MAFF], 2012). Гипервирулентный риботип ПЦР 078 вызвал серьезные вспышки среди людей во всем мире и был обнаружен как у людей, так и у свиней в европейских странах (Bakker et al., 2010; Keessen et al., 2011). В настоящее время ПЦР-риботип 078 является третьим доминирующим ПЦР-риботипом среди японских поросят, хотя он не был изолирован в клинических условиях в Японии на людях (Collins et al., 2013). Наши результаты показывают, что поросята являются потенциальными резервуарами токсигенных и устойчивых к антимикробным препаратам C. difficile , включая ПЦР риботип 078, в Японии.

Clostridium difficile может выживать в окружающей среде в течение нескольких месяцев из-за своей спорообразующей способности (Kim et al., 1981). Паразиты также могут играть роль в распространении и передаче C. difficile на свинофермах и в другие места (Burt et al., 2012). Кроме того, поскольку навоз свиней, в том числе поросят, используется для удобрения сельскохозяйственных культур, C.difficile может загрязнять почву и заражать овощи (al Saif and Brazier, 1996). Следовательно, C. difficile может легко передаваться людям как через продукты животного происхождения, так и через овощи. Кроме того, иногда свиней содержат в качестве домашних животных. Считается, что домашние животные представляют высокий риск передачи C. difficile людям из-за тесного контакта с людьми. В текущем исследовании C. difficile не было выделено на ферме F. Следовательно, снижение инфицирования C. difficile у поросят возможно.Однако мы не смогли выяснить причину отрицательного результата теста на C. difficile в ферме F, поэтому в будущих исследованиях следует оценить причину этого наблюдения. Чтобы свести к минимуму риск, связанный с C. difficile , необходимо разработать эффективные методы управления гигиеной, чтобы помочь в ограничении распространения C. difficile .

Важно провести эпидемиологический анализ для C. difficile , чтобы выяснить его происхождение от свиней в Японии.MLVA выявила, что свиньи изоляты риботипа 078 в Японии были генетически родственны европейским изолятам как от людей, так и от свиней (Bakker et al., 2010). Кроме того, японские изоляты ПЦР риботипа 078, за исключением одного штамма, выделенного от убойной свиньи (Debast et al., 2009), были токсинотипом V и содержали делецию из 39 пар оснований в гене-регуляторе токсина ( tcdC ), то же, что и изоляты европейского ПЦР риботипа 078 (Pirs et al., 2008). Многие племенные свиньи были импортированы в Японию из стран Европы и Северной Америки (Baba et al., 2010). В европейских странах выделение риботипа 078 методом ПЦР от поросят было более распространенным по сравнению с текущим исследованием (Keel et al., 2007; Hopman et al., 2011; Schneeberg et al., 2013). Распространение патогенных бактерий, таких как устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus , может быть связано с глобальным распространением свиней (Espinosa-Gongora et al., 2012). Эти результаты повышают вероятность того, что C. difficile PCR риботип 078 был доставлен в Японию через импорт племенных свиней.

В заключение, 14 риботипов ПЦР 100 штаммов C. difficile , выделенных от поросят, отличались от таковых 73 клинических изолятов человека, включенных в это исследование. Поскольку все человеческие клинические изоляты были изолированы только из двух больниц в Токио, необходимы крупномасштабные исследования для выяснения взаимосвязи между человеческими клиническими изолятами и изолятами животных в Японии. Это исследование показало, что C. difficile , распространенная среди японских свиней, представляет собой потенциальный риск диареи, связанной с антибиотиками.Хотя ПЦР-риботип 078 был выделен у японских поросят, уникальное распределение ПЦР-риботипов наблюдалось в Японии. Также необходимо постоянное наблюдение за C. difficile PCR риботипом 078 среди человеческих клинических изолятов.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Японской ассоциации ветеринаров свиней за предоставленные образцы фекалий поросят.Работа поддержана грантом JSPS KAKENHI № 26860441.

Список литературы

Альварес-Перес, С., Бланко, Дж. Л., Боуза, Э., Альба, П., Гиберт, X., Мальдонадо, Дж. И др. (2009). Распространенность Clostridium difficile у диарейных и недиарейных поросят. Вет. Microbiol. 137, 302–305. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2009.01.015

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Асаи, Т., Усуи, М., Хики, М., Каваниши М., Нагаи Х. и Сасаки Ю. (2013). Clostridium difficile выделено из фекалий свиней в Японии. J. Vet. Med. Sci. 75, 539–541. DOI: 10.1292 / jvms.12-0353

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баба К., Исихара К., Одзава М., Тамура Ю. и Асаи Т. (2010). Выделение метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus (MRSA) от свиней в Японии. Внутр. J. Antimicrob.Агенты 36, 352–354. DOI: 10.1016 / j.ijantimicag.2010.06.040

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баккер Д., Корвер Дж., Харманус К., Гурхейс А., Кессен Е. К., Фоли В. Н. и др. (2010). Родство человека и животных Clostridium difficile ПЦР изолятов риботипа 078, определенное на основе мультилокусного анализа тандемных повторов с переменным числом и устойчивости к тетрациклину. J. Clin. Microbiol. 48, 3744–3749.DOI: 10.1128 / JCM.01171-10

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бауэр, М. П., Нотерманс, Д. У., ван Бентем, Б. Х., Бразье, Дж. С., Уилкокс, М. Х., Рупник, М. и др. (2011). Инфекция Clostridium difficile в Европе: исследование на базе больниц. Ланцет 377, 63–73. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (10) 61266-4

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Институт стандартов клинических лабораторий [CLSI].(2007). Методы тестирования антимикробной чувствительности анаэробных бактерий; Утвержденный стандарт — седьмое издание. Документ CLSI M11-A7. Уэйн, Пенсильвания: Институт стандартов клинической лаборатории.

Дебаст, С. Б., ван Леенгоед, Л. А., Гурхейс, А., Харманус, К., Куиджпер, Э. Дж., И Бергверфф, А. А. (2009). Clostridium difficile ПЦР риботип 078 токсинотип V, обнаруженный у диарейных свиней, идентичный изолятам от пораженных людей. Environ. Microbiol. 11, 505–511.DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2008.01790.x

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эспиноза-Гонгора, К., Броенс, Э. М., Мудли, А., Нильсен, Дж. П., и Гуардабасси, Л. (2012). Передача штаммов MRSA CC398 между свинофермами, связанными с торговлей животными. Вет. Рек. 170, 564. DOI: 10.1136 / vr.100704

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хопман, Н. Э., Кессен, Э.К., Харманус, К., Сандерс, И. М., ван Леенгоед, Л. А., Куиджипер, Э. Дж. И др. (2011). Получение Clostridium difficile поросятами. Вет. Microbiol. 149, 186–192. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2010.10.013

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Като, Х., Като, Н., Катоу, С., Маэгава, Т., Накамура, С., и Лайерли, Д. М. (1999). Делеции в повторяющихся последовательностях гена токсина A токсин A-отрицательных, токсин B-положительных штаммов Clostridium difficile . FEMS Microbiol. Lett. 175, 197–203. DOI: 10.1016 / S0378-1097 (99) 00196-2

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Като Х., Като Н., Ватанабэ К., Иваи Н., Накамура Х., Ямамото Т. и др. (1998). Идентификация токсина А-отрицательного, токсина В-положительного Clostridium difficile с помощью ПЦР. J. Clin. Microbiol. 36, 2178–2182.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | Google Scholar

Кил, К., Бразье, Дж. С., Пост, К. В., Виз, С., и Сонгер, Дж. С. (2007). Распространенность риботипа ПЦР среди изолятов Clostridium difficile от свиней, телят и других видов. J. Clin. Microbiol. 45, 1963–1964. DOI: 10.1128 / JCM.00224-07

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кикучи, Э., Миямото, Ю., Нарушима, С., Ито, К. (2002). Дизайн видоспецифичных праймеров для идентификации 13 видов Clostridium , обитающих в кишечных трактах человека. Microbiol. Иммунол. 46, 353–358. DOI: 10.1111 / j.1348-0421.2002.tb02706.x

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким К. Х., Фекети Р., Баттс Д. Х., Браун Д., Кадмор М., Сильва Дж. И др. (1981). Изоляция Clostridium difficile из окружающей среды и контактов пациентов с антибиотико-ассоциированным колитом. J. Infect. Дис. 143, 42–50. DOI: 10.1093 / infdis / 143.1.42

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Найт, Д.Р., Теан, С., Путсатит, П., Фенвик, С., и Райли, Т. В. (2013). Поперечное исследование выявило высокую распространенность штаммов Clostridium difficile без ПЦР риботипа 078 у австралийских телят при убое. Заявл. Environ. Microbiol. 79, 2630–2635. DOI: 10.1128 / AEM.03951-12

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Martin, H., Willey, B., Low, D. E., Staempfli, H.R., McGeer, A., Boerlin, P., et al. (2008). Характеристика штаммов Clostridium difficile , выделенных от пациентов в Онтарио, Канада, с 2004 по 2006 гг. J. Clin. Microbiol. 46, 2999–3004. DOI: 10.1128 / JCM.02437-07

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Министерство сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства [MAFF]. (2012). Объем продаж лекарственных средств, квазипрепаратов и медицинских изделий для животных в 2005–2010 гг. . Токио: Японская ассоциация ветеринарных продуктов.

Норман К. Н., Харви Р. Б., Скотт Х. М., Хьюм М. Э., Эндрюс К. и Броули А. Д. (2009). Различная распространенность Clostridium difficile в комплексных операциях на свиньях. Анаэроб 15, 256–260. DOI: 10.1016 / j.anaerobe.2009.09.006

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ока К., Осаки Т., Ханава Т., Курата С., Окадзаки М., Манзоку Т. и др. (2012). Молекулярная и микробиологическая характеристика изолятов Clostridium difficile в единичных случаях, рецидивах и повторных инфекциях. J. Clin. Microbiol. 50, 915–921. DOI: 10.1128 / JCM.05588-11

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перссон, С., Торпдал, М., и Олсен, К. Э. (2008). Новый метод мультиплексной ПЦР для обнаружения генов Clostridium difficile токсина A (tcdA), токсина B (tcdB) и бинарного токсина (cdtA / cdtB) в датской коллекции штаммов. Clin. Microbiol. Заразить. 14, 1057–1064. DOI: 10.1111 / j.1469-0691.2008.02092.x

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ричардс, М., Нокс, Дж., Эллиотт, Б., Маккин, К., Лайрас, Д., Уоринг, Л. Дж. И др.(2011). Тяжелая инфекция Clostridium difficile ПЦР риботип 027, приобретенная в Мельбурне, Австралия. Med. J. Aust. 194, 369–371.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | Google Scholar

Рупник М., Брейзер Дж. С., Дюрден Б. И., Грабнар М. и Стаббс С. Л. (2001). Сравнение токсинотипирования и ПЦР-риботипирования штаммов Clostridium difficile и описание новых токсинотипов. Микробиология 147, 439–447.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | Google Scholar

Шнееберг, А., Neubauer, H., Schmock, G., Baier, S., Harlizius, J., Nienhoff, H., et al. (2013). Clostridium difficile генотипов в популяциях поросят в Германии. J. Clin. Microbiol. 51, 3796–3803. DOI: 10.1128 / JCM.01440-13

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Spigaglia, P., and Mastrantonio, P. (2002). Молекулярный анализ локуса патогенности и полиморфизма предполагаемого негативного регулятора продукции токсина (TcdC) среди клинических изолятов Clostridium difficile . J. Clin. Microbiol. 40, 3470–3475. DOI: 10.1128 / JCM.40.9.3470-3475.2002

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стаббс, С. Л., Бразье, Дж. С., О’Нил, Г. Л., и Дюрден, Б. И. (1999). ПЦР нацелена на межгенную спейсерную область гена 16S-23S рРНК Clostridium difficile и конструирование библиотеки, состоящей из 116 различных риботипов ПЦР. J. Clin. Microbiol. 37, 461–463.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | Google Scholar

Неонатальные поросята, получавшие кормление смесью и инфицированные Clostridioides difficile, несут очень разнообразный и многочисленный набор генов устойчивости к противомикробным препаратам

Предпосылки новорожденные свиньи.Кроме того, ИКД у новорожденных поросят вызывает изменения в микробной колонизации кишечника. Мы предположили, что несбалансированная микробная колонизация у поросят с ИКД может быть связана с измененным количеством генов устойчивости к противомикробным препаратам.

Результаты Мы проанализировали метагеномные данные фекалий лактирующих свиноматок (S), их поросят во время сосания (SP), тех же поросят через две недели после отъема (WP), 5-дневных искусственно выращенных братьев и сестер на искусственном вскармливании (FP) и FP инфицированы C. difficile (FP-CD) для определения состава микробиоты и изобилия гена устойчивости к противомикробным препаратам.Поросята FP и FP-CD имели незрелую микробиоту и повышенное количество генов устойчивости к противомикробным препаратам. Совместное присутствие генов, кодирующих устойчивость к аминогликозидам (например, aph (3 дюйма) — lb , aph (6) -ld , ant (2 дюйма) — la ), β-лактамов ( bla _{CTX − M} , bla _TEM ), фторхинолоны ( pat (A) макролиды ( миль / ч (A)), сульфаниламиды ( sul1, sulpeptides (e.грамм. pmrB, pmrC, arnA, bac (A)) и тетрациклины (например, tet (A-D),). Обнаружена сильная связь между таксонами Escherichia , Streptococcus , Shigella , Enterococcus и Fusobacterium с увеличением резистома у поросят FP и FP-CD.

Заключение Повышенное количество генов устойчивости к противомикробным препаратам в искусственном вскармливании и сопутствующая ИКД могут быть связаны с терапевтической устойчивостью в более позднем возрасте и требуют дальнейших исследований.

Ключевые слова